培養マクロファージにおけるリーシュマニア病原性の評価

カバーガラスに骨髄由来マクロファージを含むマルチウェルプレートから始めます。

マクロファージをリーシュマニア前乳母体(寄生虫の感染段階)で治療します。

インキュベーション中、寄生虫はマクロファージと相互作用し、相互作用部位の周りのF-アクチンの集合を促進します。

マクロファージは、F-アクチンで囲まれたファゴソームに寄生虫を飲み込み、複製ニッチである寄生液胞またはPVを形成します。

PV内では、寄生虫は生存因子を放出し、液胞の周りのF-アクチンの蓄積を増加させ、リソソームとの融合を阻害します。

さらに、寄生虫はマクロファージペプチドホルモンであるヘプシジンの産生をアップレギュレートし、鉄の放出を阻害し、細胞内の鉄レベルを上昇させます。

液胞への鉄の流入は、プロスチゴートから病原性アマスティゴートへの分化を促進し、それらの増殖を促進し、病原性を高めます。

インキュベーション後、洗浄して遊離寄生虫を除去し、感染したマクロファージを固定して透過処理します。

核酸蛍光色素を導入して、感染したマクロファージとアマスチゴートの核を染色します。

蛍光顕微鏡下では、マクロファージの大きな核の周りに集まった小さな核が細胞内寄生虫の存在を確認し、リーシュマニアの病原性を示しています。

培養後7日目または8日目に、真空ラインに取り付けられた吸引チップを使用して、オートクレーブ滅菌された4つの12mmガラスカバーガラスを6ウェル培養プレートの各ウェルの底に重ならずに移します。実験の各時点で同一のプレートを準備します。次に、骨髄由来マクロファージ培養物を、新鮮な摂氏37度のPBSとカルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、各プレートに1ミリモルのEDTAを添加します。

摂氏37度で5分間後、剥離した細胞を50ミリリットルの円錐形チューブにプールし、カルシウムとマグネシウムを含まない追加の5ミリリットルのPBSで各プレートを2回すすぎます。遠心分離後、マクロファージを氷上の5〜10mlの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地に再懸濁します。カウント後、新鮮な骨髄由来マクロファージ培地で細胞を1ミリリットルあたり5 x 10⁵の濃度に希釈し、ウェルあたり2ミリリットルの細胞を6ウェルプレートに加えます。次に、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。

細胞をLアマゾネンシスで感染させるには、寄生虫懸濁液を適切な実験的感染の多重度に希釈し、実験のすべての時点を含むすべての6ウェルプレートの各ウェルに50〜100マイクロリットルの寄生虫を追加します。骨髄由来マクロファージを適切な感染期間と温度でインキュベートします。

次に、ウェルあたりカルシウムまたはマグネシウムを含まない2ミリリットルの新鮮な摂氏37度のPBSでウェルを3回洗浄し、最初の時点サンプルを1.5〜2mlの2%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。後の時点に対応するプレートについては、2ミリリットルの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地を各ウェルに加え、プレートを適切なインキュベーターに戻します。次に、先ほど示したように、残りの各時点で細胞を固定して洗浄し、サンプルを摂氏4度で新鮮なPBSに保存します。

細胞をDAPIで染色するには、上清をカルシウムおよびマグネシウムを含まない1.5mlの新鮮なPBSに置き換え、室温で10分間0.1%非イオン性界面活性剤を添加し、続いてカルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSで2ミリリットルを3回洗浄します。次に、1ミリリットルのPBSに1ミリリットルのDAPIあたり2マイクログラムで細胞を室温で1時間染色します。3回洗浄した後、カバーガラスをセル側を下にして、市販の色あせ防止封入試薬が取り付けられた個々のガラス顕微鏡スライドに置きます。

次に、感染細胞の数を定量化するために、蛍光顕微鏡の100倍浸漬油対物レンズとエマニュエルカウンターを使用して、DAPIで染色された各大きなマクロファージ核の周囲にクラスター化された小さなアマスチゴート核の数を特定します。