病原菌による胃オルガノイドのマイクロインジェクションによる感染モデルの確立

実体顕微鏡下で、胃オルガノイド、分化した胃細胞で構成される三次元細胞構造、幹細胞を観察します。

胃病原体であるヘリコバクター・ピロリを充填したマイクロインジェクターを導入します。

標的オルガノイドに針を挿入し、細菌懸濁液を注入します。

内腔内に濁った溶液が発生するのを観察します。

ピロリ菌は、その表面に特定のアドヘシンタンパク質を使用して胃細胞受容体に結合し、細菌と宿主細胞の間に安定した相互作用を確立します。

この相互作用は、宿主細胞膜に向かって伸びる大きなトンネル状の構造である細菌分泌線毛の伸長を引き起こします。

ピロリ菌は、分泌線毛を使用して、細胞傷害性関連遺伝子AまたはCagAなどの病原性因子を宿主細胞に注入します。

細胞内に入ると、CagAは宿主細胞キナーゼによるリン酸化を受けます。

リン

酸化 CagA は、宿主細胞の機能を変化させる複数の細胞内シグナル伝達カスケードを規制解除し、癌性形質転換を促進します。

さらなる分析のために感染したオルガノイドを収集します。

オルガノイドのマイクロインジェクションを開始するには、ピロリ菌を採取し、標準プロトコルに従って基礎培地で洗浄します。光学密度測定で細菌数を測定した後、培養物を基礎培地で1ミリリットルあたり1 x 10⁹細菌に希釈します。

マイクロピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーを2本の注射針に引き込み、清潔なシャーレに保管します。次に、鉗子を使用して、1本の注射針の先端を壊し、幅約10マイクロメートルの開口部を作ります。

実体顕微鏡で作業し、滅菌培養フード内に設置し、針を注射ホルダーに挿入し、マイクロマニピュレーターに固定します。約10マイクロリットルの細菌溶液を針に取り込みます。次に、胃オルガノイドを含む4ウェル細胞培養プレートを実体顕微鏡下に置きます。

マイクロマニピュレーターでナビゲートし、針をオルガノイドの近くに配置します。針を1回の素早い動きでオルガノイドに挿入し、オルガノイドの中心に約0.2マイクロリットルの細菌溶液を注入します。経験により、井戸内の最大のオルガノイドの約30個を5分で注入できます。注入されたオルガノイドを細胞培養インキュベーターで所望の時間インキュベートします。

多くの場合、この技術を初めて使用する個人は、オルガノイドを効率的に標的にすることが難しいと感じているため、苦労します。マウス胃オルガノイドは嚢胞性に成長し、標的にするのが最も簡単です。したがって、マウス胃オルガノイドに色素を注射することは、この技術の良い習慣かもしれません。