真核細胞内のCoxiella変異体の細胞内増殖の評価

接着した上皮細胞を含むマルチウェルプレートを取り、緑色の蛍光タンパク質タグ付きコキシエラ変異体で処理します。複製に重要なIV型分泌系遺伝子またはT4SS遺伝子に変異があるものもあります。

複製変異体は上皮細胞と相互作用し、コキシエラの飲み込みを引き起こし、コキシエラ含有液胞(CCV)を形成し、リソソーム関連膜糖タンパク質-1(LAMP1)をCCVに動員します。

これにより、IV型分泌系を介して細胞細胞質へのエフェクタータンパク質の分泌が促進され、細菌の複製が促進されます。

T4SS遺伝子変異を持つ変異体は複製されないままです。

インキュベーション後、細胞を蛍光色素で染色し、固定し、細胞膜を透過処理します。

CCV上のLAMP1タンパク質と相互作用するLAMP1特異的一次抗体を導入します。

赤色蛍光色素標識二次抗体と重ね合わせ、一次抗体と相互作用し、ヘヒスト色素が細胞核を染色します。

落射蛍光顕微鏡下では、核の近くに緑色のコキシエラが少ない赤色蛍光液胞は、コキシエラ変異体の複製に欠陥があることを示しています。

しかし、細胞内に多くの緑色のコキシエラを含む液胞は、複製コキシエラ変異体の細胞内増殖が成功していることを示しています。

テキストプロトコルに従ってRPMI培地中に1ミリリットルあたり10〜⁵細胞のVero細胞懸濁液を調製した後、平らで透明な底を持つ黒い96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの懸濁液を分注します。プレートを400倍g、室温で5分間遠心分離し、摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。

翌日、コキシエラ変異体を含む室温の96ウェルプレートを解凍し、ディープウェル96ウェルプレートで、フェノールレッドとFBSを含まない300マイクロリットルのRPMIで150マイクロリットルの細菌懸濁液を希釈します。次に、Vero細胞から培地を取り出し、希釈したCoxiella変異体のウェルあたり100マイクロリットルを分注します。A1ウェルをネガティブコントロールとして使用し、ウェルA2とA3をポジティブコントロールとして使用します。

エアロゾルタイト遠心分離機プレートホルダーを使用して、プレートを400倍g、室温で10分間遠心分離します。次に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素の加湿雰囲気で2時間インキュベートした後、細菌含有培地をウェルあたり100マイクロリットルの新鮮な完全なRPMI培地に交換します。蛍光マイクロプレートリーダーとフルオレセイン用フィルターを使用して、GFP蛍光を7日間毎日測定します。

感染後7日目に、培地をプレートから取り出し、細胞透過性蛍光色素を1〜1000希釈したウェルあたり50マイクロリットルの新鮮な完全培地と交換します。細胞を30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、培地をPBS中の4