嫌気性細菌-宿主細胞相互作用を研究するための細菌感染アッセイ

内皮細胞の培養から始めます。

メディアを嫌気性メディアに交換します。温度平衡のために嫌気性チャンバーでインキュベートします。

病原性嫌気性細菌であるポルフィロモナス・ジンジバリスを加え、短時間インキュベートします。

この細菌は線毛として知られるタンパク質性突起を持ち、内皮細胞上の特定の接着分子に結合し、細菌の付着

を促進します。

この結合により細胞内シグナル伝達カスケードが引き起こされ、アクチン細胞骨格の再構成とファゴソームへの細菌の内在化が起こります。

インキュベーション後、培地を取り除きます。嫌気性緩衝液で洗浄し、付着していない細胞外細菌を除去します。

中性洗剤を加えて宿主細胞膜を透過性化し、細胞溶解を誘導し、損傷を与えることなく内在化して表面に付着した細菌を放出します。

ライセート含有細菌を培地で希釈し、連続希釈液を調製します。

これらの希釈液を血液寒天プレートにプレートします。嫌気性条件下でインキュベートして、ポルフィロモナス・ジンジバリスが増殖してコロニーを形成できるようにします。

インキュベーション後、各プレート上のコロニー形成単位(CFU)をカウントして、表面に付着および内在化された細菌を定量化し、細菌と宿主細胞の相互作用を示します。

ポ

ルフィロモナス・ジンジバリスの培養と実験のために、ビニール嫌気性チャンバーは、80%の窒素、10%の水素、および10%の二酸化炭素を含む人工雰囲気で維持されます。

30枚

の血液寒天プレート、500ミリリットルのPBS、およびミリリットルの血管内皮増殖因子(VEGF培地)を24時間前に嫌気性チャンバー内に配置して、試薬を平衡化します。

VEGF培地中の6ウェルプレートにウェルあたり5つのヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を10回4回播種し、付着のために細胞培養インキュベーターに一晩放置します。添付のテキストに記載されているように、ポルフィロモナス・ジンジバリス培養物を脳心臓注入またはBHI培地で調製し、660ナノメートルでの培養物の光学密度が0.5〜0.7の範囲である間、培養物を対数期に到達させます。

細菌を15ミリリットルのチューブに移し、好気性曝露を防ぐためにキャップの周りにパラフィルムを巻き付けます。次に、細菌を5,000倍gで10分間遠心分離します。嫌気性チャンバー内で、ペレット化された細菌を嫌気性PBSで洗浄し、5,000回gで10分間再度スピンダウンします。細菌をVEGF培地に再懸濁します。

HUVECをポルフィロモナス・ジンジバリスに感染させるには、6ウェルプレートをインキュベーターから嫌気性チャンバーに移します。試験ウェルから培地を吸引し、嫌気性PBSで3回洗浄します。

トリパンブルー排除アッセイにより、1つの代表的なウェルから細胞数を決定します。次に、嫌気性VEGF培地をウェルあたり2ミリリットルを加え、プレートを嫌気性インキュベーターに摂氏37度で20分間置いて平衡化します。

細菌の光学密度を測定し、細菌と細胞の比率100対1の感染の多重度で細胞に感染するために、適切な量のVEGF培地に再懸濁します。細菌懸濁液を細胞に加え、感染のために摂氏37度で30分間インキュベートします。細胞溶解のために、嫌気性チャンバー内で、BHI培地中に体積あたり1重量のサポニン溶液を調製し、0.2ミクロンのフィルターでろ過します。

宿主細胞との細菌の相互作用を研究するには、インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、感染培地を吸引します。嫌気性PBSで3回洗浄します。次に、各ウェルに2ミリリットルのサポニン溶液を加え、15分間インキュベートして細胞溶解を可能にします。

次に、ウェルの底から細胞をこすり落とし、細胞ライセートをBHI培地で1対1に希釈します。次に、1から100まで順次希釈します。血液寒天プレートに適切な希釈液の200マイクロリットルをプレートします。プレートをパラフィルムで包み、摂氏37度の嫌気性インキュベーターで7日間インキュベートして、コロニー形成を可能にします。次に、ライトボックスを使用して、各プレート上のコロニー形成ユニットまたはCFUをカウントします。