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球菌懸濁液を含むマルチウェルプレートから始めます。
細菌表面抗原と相互作用する細菌表面抗原標的抗体を導入します。これにより細菌が抗体でコーティングされ、免疫認識のためのオプソニン化細菌が形成されます。
補体タンパク質を含むウサギ血清を添加したヒト末梢血リンパ球由来の好中球をウェルに播種します。
インキュベーション中に、C3bなどの補体タンパク質が細菌表面に沈着し、抗体オプソニン化細菌にオプソニンコーティングが追加され、好中球による細菌の認識が促進されます。
好中球の特定の表面受容体は細菌のオプソニンと相互作用し、食作用による細菌の飲み込みを促進します。
ファゴソーム内では、好中球が飲み込まれた細菌を分解し、緩衝液内の細菌数を減少させます。
インキュベーション後、希釈した共培養液を血液寒天プレートにスポットして、個々の細菌がコロニーを形成できるようにします。
オプソニン処理細菌のコロニー数と未処理細菌を比較します。
オプソニン処理を受けたコロニーが少ないほど、細菌の死滅が高いことを示し、オプソノファゴサイト殺傷が成功していることを示唆しています。
細菌ストックのチューブ1本を解凍します。細菌を6,000倍gで2分間ペレット化し、前のステップで得られた最適な希釈液で細胞ペレットをOBBに再懸濁します。丸底96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10マイクロリットルの再懸濁細菌希釈液をピペットで移動します。次に、20マイクロリットルの適切な抗体または薬物処理を各実験ウェルに2回ずつ加えます。
コントロールウェルには、処理ウェルに使用されるバッファーに応じて、1X PBSまたはOBBを使用します。サンプルプレートを室温で約90RPMで1時間振とう。
3日前にDMFで処理したHL60分化細胞を回収するには、細胞を500倍gで3分間ペレット化します。上清を捨て、ペレットを少なくとも10ミリリットルの1XPBSで洗浄します。洗浄した細胞を500倍gで3分間ペレット化します。上清を廃棄し、細胞をOBBに再懸濁します。
滅菌済みの希釈されていない赤ちゃんウサギ血清を1〜5の最終容量で加えます。1時間の細菌培養後、各サンプルを2つのグループの重複ウェルに分割します。次に、50マイクロリットルのHL60補体混合物をウェルの各実験セットに追加し、50マイクロリットルのOBBを細菌のウェルのみに追加します。96ウェルプレートを摂氏37度で1時間振とう。
サンプルをプレートするには、各ウェルをOBBで1〜5の最終容量で希釈し、各サンプルの容量が少なくとも50マイクロリットルになるようにします。次に、各サンプル 50 マイクロリットルを細菌培養プレートの指定された領域に直接ピペットで移し、サンプル間の適切な間隔を確保します。蓋をして、サンプルを室温で約15分間乾燥させます。
プレートを反転させ、摂氏30度で一晩培養します。あるいは、嫌気性ジャーに培養プレートを入れて、無酸素状態が細菌の増殖に影響を与えるかどうかをテストしたり、形態を制御したりします。一晩培養した後、指定された各サンプル領域のコロニーをカウントし、各セットの生細胞の数を対応するコントロールと比較することにより、データの分析に進みます。
この技術を初めて確立する際の最も難しい側面は、細菌ストックの開始CFUを最適化することと、HL60細胞が効果的に分化することを保証することである可能性があります。