宿主内皮細胞における内在化ポルフィロモナス・ジンジバリスの評価

ポルフィロモナス・ジンジバリス感染中、嫌気性細菌の線毛は宿主細胞上の特定の受容体に結合します。

この結合により細胞内シグナル伝達カスケードが開始され、ファゴソーム内でアクチンの再構成と細菌の内在化が起こります。

内

皮細胞内の内在化したポルフィロモナス・ジンジバリスの生存率を in vitro で評価するには、カバーガラスに付着した内皮細胞を含むマルチウェルプレートを取ります。

ポルフィロモナス・ジンジバリス懸濁液を追加します。細菌の内在化を促進するためにインキュベートします。

培地を取り除き、嫌気性バッファーを使用して洗浄し、内在化していない細菌を除去します。

内皮細胞に不浸透性の抗生物質を含む培地を加えて、表面に付着した細菌を除去します。

穏やかな界面活性剤とインキュベートして内皮細胞を溶解し、溶解を引き起こすことなく細菌を放出します。

収集したライセートを培地で希釈します。ライセートの連続希釈液を調製します。

希釈液を血液寒天プレートにプレートします。嫌気性条件下でインキュベートして、ポルフィロモナス・ジンジバリスが成長し、目に見えるコロニーを形成します。

コロニーを数えて、ポルフィロモナス・ジンジバリスが内皮細胞内に侵入して生き残る能力を評価します。

HUVEC細胞の感染後、嫌気性PBSで細胞を3回洗浄します。次に、事前に最適化された濃度の抗生物質を添加した2ミリリットルのVEGF培地をHUVEC細胞に加えます。細胞を1時間インキュベートします。培地を吸引し、BHI中の1%サポニン溶液2ミリリットルを各ウェルに加えます。15分間インキュベートします。

次に、溶解した細胞をこすり落とし、遠心分離管に溶解物を回収します。ライセートをBHI培地で1対1に希釈し、1〜100から開始する連続希釈液を調製します。血液寒天プレートに適切な濃度の200マイクロリットルをプレートします。嫌気性チャンバーで細菌を7日間増殖させてから、コロニーを数えます。