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表面マーカーによって区別される付着性M1およびM2マクロファージ亜集団から始めます。これらの細胞は、蛍光標識結核菌に感染しています。
FACSバッファーを培養ウェルに加えます。
バッファー中のEDTAは、培養ウェルからの細胞の剥離を可能にします。
細胞懸濁液を微量遠心チューブに移します。
チューブを遠心分離します。上清を捨てます。蛍光色素結合抗マクロファージ抗体カクテルおよび生存率色素Zombie-UVに細胞を再懸濁します。
Zombie-UV蛍光色素は、損傷した膜を通って死細胞に入り、細胞質タンパク質に結合し、未染色の生存細胞との明確な分化を可能にします。
さらに、蛍光結合抗マクロファージ抗体はマクロファージ上の標的抗原に結合し、亜集団の差次検出を可能にします。
細胞を洗浄して、結合していない抗体を除去します。遠心機。上清を取り除きます。
細胞を固定バッファーに再懸濁してタンパク質を架橋し、細胞の形態を維持し、分析中に安全に取り扱うためにマイコバクテリアを不活性化します。
最後に、フローサイトメトリー用にサンプルを遠心分離して処理します。
適切なゲーティング戦略を使用して、マイコバクテリウムに感染した亜集団の割合を決定します。
フローサイトメトリー用に細胞を染色するには、感染した細胞をウェルあたり0.5ミリモルEDTAを添加した1ミリリットルのFACSバッファーと少なくとも30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、穏やかなピペッティングで分離した細胞を収集し、遠心分離のために細胞を個々のスクリューキャップ付き微量遠心チューブに移します。
細胞を約50マイクロリットルの蛍光色素結合抗ヒト抗体カクテルおよび目的の生存率色素に再懸濁し、光から保護された摂氏4度で細胞を30分間インキュベートします。
洗浄後、光から保護された室温で30分間、200マイクロリットルの新しく調製した固定バッファーで細胞を固定します。固定および洗浄後、細胞を400マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、細胞を1ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
細胞を分析するには、補償ビーズを使用してカクテル中の各蛍光色素結合抗体の蛍光シグナルを補償し、未染色の細胞を使用して陰性細胞集団のゲートを設定します。次に、サンプルあたり最低50,000個の細胞を取得します。