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蛍光標識細胞質タンパク質を含むがん細胞の培養を取ります。
サイトカイン誘導キラー細胞またはCIK細胞(ナチュラルキラー細胞様特性を持つエフェクターT細胞)を、抗腫瘍活性を有するものを加える。
CIK細胞上のナチュラルキラーグループ2メンバーDまたはNKG2D受容体は、癌細胞上のストレス誘導性タンパク質に結合します。
この結合により、CIK細胞が細胞質顆粒毒素(パーフォリンとグランザイム)を放出するように誘導されます。
パーフォリンはがん細胞膜に細孔を形成し、カスパーゼを活性化してアポトーシスを誘導するグランザイムの侵入を可能にします。
インキュベーション後、細胞を回収します。蛍光核酸結合細胞生存率色素を加えます。
色素は損傷した細胞膜を通って DNA に結合し、二重染色された死細胞になります。
細胞膜が無傷であるため、生細胞は色素を透過しません。
細胞をフローサイトメーターに通して、単一蛍光を示す生細胞と二重蛍光を示す死細胞を検出します。
散布図を作成して死んだがん細胞の割合を測定し、CIK細胞の細胞毒性効果を定量化します。
細胞毒性アッセイを実行するには、CIK細胞とヒト慢性骨髄性白血病K562細胞を共培養し、1ミリリットルのK562細胞を6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットル/ミリリットルあたり50万細胞の密度で添加します。次に、テキストプロトコルに記載されているように、CIK細胞の有無にかかわらず、1ミリリットルの基礎培地を6ウェルプレートに加えます。少なくとも3回、上下に穏やかにピペッティングして、細胞懸濁液を混合します。
プレートをインキュベーターに24時間入れます。次に、テキストプロトコルに記載されているように、CIK細胞の有無にかかわらず、CIK細胞の有無にかかわらず1ミリリットルの基礎培地を6ウェルプレートに追加することにより、CIK細胞と卵巣OC-3細胞を共培養します。インキュベーター内のブレードで少なくとも3回静かに上下にピペッティングして、細胞懸濁液を24時間混合します。インキュベーション後、CIK-K562細胞懸濁液を15ミリリットルの滅菌チューブに直接収穫します。
CIK-OC-3グループから懸濁液細胞と接着細胞の両方を採取するには、まず、細胞懸濁液を15ミリリットルの滅菌チューブに移します。1ミリリットルの滅菌PBSでウェルを洗浄します。PBSを回収し、チューブに加えます。次に、0.5ミリリットルの細胞解離酵素溶液を加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。
同じチューブから1ミリリットルの溶液を対応するウェルに加え、1ミリリットルの滅菌ピペットで少なくとも3回上下にピペッティングして細胞を穏やかに混合します。すべての細胞を同じチューブに集めます。300 x g で 10 分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。細胞を300 x gで10分間ペレット化します。次に、上清を吸引し、細胞を100マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁します。
5マイクロリットルの7-AAD色素を細胞懸濁液に加えます。1ミリリットルの滅菌ピペットで少なくとも3回上下にピペッティングして、細胞を穏やかに混合します。10分間インキュベートし、分析前に暗所に置いてください。
細胞溶解能力アッセイを実行するには、細胞懸濁液を混合し、フローサイトメトリーの調製を繰り返します。[新しい標本]ボタンをクリックして、実験に標本とチューブを追加します。テキストプロトコルに記載されているようにチューブに名前を付けます。
細胞溶解アッセイ用の散乱ゲーティングシステムを作成するには、まずチューブ1を選択し、ドットプロットボタンをクリックします。FSC-A/SSC-Aプロットを作成するには、FSC-Aしきい値が50,000を超えるすべてのイベントに長方形のゲートを描画して、細胞の破片を除外します。新しいドットプロットの SSC-A/CFSE パラメーターを選択します。次に、新しいドットプロットの7-AAD/CFSEパラメータを選択し、4つのサブ母集団を定義する4象限ゲートを描画します。
[サンプルのロード]ボタンをクリックして、最初にブランクコントロールサンプルを分析します。SSC-AとFSC-Aの電圧を調整します。CFSEおよび7-AADチャネルパラメータを使用して、死細胞集団を特定します。各検体に20,000を超えるCFSE陽性細胞からのデータを記録します。個々の検体の統計値を含むファイルを開き、生体不可能な細胞集団を分析し、データを分析ファイルにエクスポートします。