がん細胞の好中球細胞外トラップへの付着を検出するためのin vitro接着アッセイ

がん微小環境では、活性化された好中球は、がんの進行に重要な役割を果たす細胞外 DNA 線維、ヒストン、顆粒タンパク質で構成される好中球細胞外トラップ (NET) を放出します。

がん細胞とNETの接着をin vitroで研究するには、マルチウェルプレートウェルにNET懸濁液を添加します。NET単分子層形成のためのインキュベート

インキュベーション後、付着していないNETを除去します。

タンパク質溶液を加えて、ウェル内の遊離結合部位をブロックします。

蛍光標識癌細胞をNET単分子層上にピペットで移動

させる

がん細胞上の特定の表面受容体は NET と相互作用し、細胞接着を促進します。

インキュベーション後、ネガティブコントロールウェルから培地を廃棄します。

デオキシリボヌクレアーゼを添加してNETを分解し、細胞を剥離します。

ネガティブコントロールおよびテストウェルから溶液を取り除きます。バッファーを使用して、非接着細胞を除去します。

付着したがん細胞をホルムアルデヒドでNETに固定します。

蛍光顕微鏡を使用して、NETに付着した蛍光がん細胞を視覚化します。

テストウェルはNETに対するがん細胞の有意な接着を示しますが、デオキシリボヌクレアーゼ処理されたNETはがん細胞の接着レベルの低下を示します。

100マイクロリットルのNETストックを96ウェルの平底プレートの各ウェルに加え、プレートを暗闇で摂氏4度で一晩インキュベートしてウェルをコーティングします。12〜20時間後、顕微鏡を使用して、ウェルの底に無細胞NETの均一な単層が形成されることを確認します。単層が確認されたら、底の単層を破壊しないように注意しながら、すべての非付着性物質をウェルからそっと吸引します。

これは、この手順の最も困難な側面です。適切なNET単層を維持するには、プレートを非常に慎重に扱う必要があります。ウェルの側面にすべての試薬と細胞をゆっくりと加えます。非常に穏やかに吸引し、吸引先端でウェルの底に触れないようにしてください。

非付着性物質を除去した状態で、100マイクロリットルの1%ウシ血清アルブミン遮断溶液を各ウェルにそっと加え、室温で1時間放置します。NET単分子層を破壊する可能性があるため、プレートをかき混ぜたり振ったりしないでください。

次に、標準的な技術を使用して、A549がん細胞が70〜80%コンフルエントになったときに採取することにより、A549がん細胞を調製します。100マイクロリットルあたり2 x 10⁴細胞の濃度で細胞を培地に再懸濁します。培地1ミリリットルあたり1マイクロリットルのCFSEを加えて細胞を染色し、室温で10分間放置します。

次に、細胞を摂氏4度で450倍gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、培地の初期容量で細胞を再懸濁して、培地100マイクロリットル