免疫学的研究のための細菌細胞の染色と調製

指数関数的な段階の細菌培養物を含むチューブから始めて、一貫した結果を得るために均一で活発に増殖する細菌を確保します。

遠心分離して細胞を収集します。破片を含む上清を吸引し、細胞を再懸濁します。

細胞透過性の赤色蛍光色素を導入します。色素分子は細菌の細胞膜を貫通して核様体に到達し、DNAと結合して細菌に赤色蛍光を与えます。

遠心分離機で染色された細菌をペレット化し、結合していない色素含有上清を吸引します。

細菌を増殖培地に再懸濁して、細胞の生存率を維持します。

光度計を使用して、希釈した細菌懸濁液の吸光度を600ナノメートルで測定します。

吸光度値を標準曲線と比較して、細菌濃度を決定します。

所

望の量の染色された細菌懸濁液を、増殖培地を含む新しいチューブに移します。これは、感染の多様性、またはMOIを表す宿主細胞感染に望ましい細菌濃度を達成するためです。

所望のMOIを持つ染色された細菌は、免疫学的研究の準備が整います。

まず、室温で13,000倍gで2分間遠心分離することにより、細菌培養物を指数関数的に収穫します。細胞ペレットを1ミリリットルPBSで洗浄した後、細菌ペレットを1ミリリットルPBSに再懸濁します。

600ナノメートルで光学密度を測定することにより、細菌懸濁液の濃度を決定します。次に、細菌懸濁液を染色するために、500倍濃縮ストックグリーンまたはレッド染色染料2マイクロリットルを1ミリリットルの細菌懸濁液に加え、色素を1倍に希釈します。細胞を室温で30分間インキュベートし、暗闇の中で穏やかに回転させます。

30分後、染色した細菌を13,000倍gで2分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。染色した細菌細胞を13,000倍gで2分間遠心分離して収集します。ペレットを1ミリリットルの新鮮なF-12K培地に再懸濁し、各培養物の光学密度を600ナノメートルで測定します。その後、感染の多様性と宿主細胞濃度に基づいて、培養物を所望の濃度に希釈します。