リン酸化フローサイトメトリーを用いた間質性サイトカイン誘導性細胞内タンパク質リン酸化の評価

白血病細胞をサイトカインなどの刺激因子を含まない増殖培地に採取し、インキュベートします。

刺激因子がないため、細胞内リン酸化タンパク質は脱リン酸化を起こし、本来の状態に戻ることができます。

遠心分離して培地を取り除きます。サイトカイン、胸腺間質リンパポエチン、またはTSLPを含む間質上清に細胞を再懸濁します。

TSLP は白血病細胞上の受容体に結合し、受容体二量体化を引き起こします。

これにより、2つのヤヌス関連キナーゼ、またはJAKが近づき、相互のトランスリン酸化が促進されます。

活性化されたJAKは受容体の細胞質尾部をリン酸化し、シグナルトランスデューサーと転写活性化因子であるSTATモノマーのドッキング部位を作り出します。

リン

酸化されると、STATは二量体化して受容体から分離し、下流の細胞プロセスを調節します。

細胞内タンパク質のリン酸化状態を維持するために細胞を固定します。

細胞を透過溶液で処理して、細胞膜透過性を高めます。

蛍光標識抗体を添加して、リン酸化タンパク質を標識します。

蛍光シグナルのフローサイトメトリー測定はTSLP誘発STATリン酸化と相関する

操作された間質から生成された上清を検証するには、サイトカイン発現間質でコントロールから採取した上清サンプルを解凍し、R20培地で条件ごとに3ウェルの白血病細胞株を2倍10から5番目の細胞濃度で96ウェル組織培養プレートにプレートします。細胞を摂氏37度で2時間インキュベートして、以前の培養物からのリン酸化を失います。

次に、各ウェルから個々の4ミリリットルチューブに細胞を移し、遠心分離によって細胞を収集します。ペレットを実験条件ごとに600マイクロリットルに再懸濁し、各条件ごとにウェルあたり200マイクロリットルの細胞を3回プレートします。特定の市販のリン酸化アッセイに従って、適切な期間細胞をインキュベートします。

インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞をペレット化し、メーカーのプロトコルに従ってリン酸化フローサイトメトリー染色を介して細胞を標識します。次に、標準的なフローサイトメトリー分析プロトコルを使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析し、間質上清中のサイトカインが白血病細胞をリン酸化することを確認します。