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Jurkat細胞(Tリンパ球白血病細胞)の懸濁液を取ります。
アリコートを細胞生存率色素と混合し、適切な数の生細胞を確保します。
細胞を培養皿にプレートし、紫外線CまたはUVC、必要な時間放射線を照射します。
UVC は細胞に浸透して DNA に吸収され、ピリミジン光生成物を形成します。
照射後、細胞をインキュベートします。広範なUVCを介したDNA損傷は、内因性アポトーシス経路を開始し、ミトコンドリアの外膜上のアポトーシス促進タンパク質を活性化します。
活性化されたタンパク質はオリゴマー化して膜細孔を形成し、膜間隙から細胞質にシトクロムCを放出します。
シトクロームCはアポトーシスプロテアーゼ活性化因子-1と複合体を形成し、アポトソーム複合体を形成します。アポトソームはカスパーゼを活性化し、アポトーシスを引き起こします。
蛍光色素標識アネキシンVを導入して、アポトーシス細胞マーカーであるホスファチジルセリンを膜に標識し、損傷した膜から侵入するヨウ化プロピジウムを添加してDNAを標識します。
フローサイトメトリーを使用して、アネキシンV標識初期アポトーシス細胞と二重染色後期アポトーシス細胞を決定します。
まず、原稿の指示に従って補充した基礎細胞培養培地でJurkat T細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。Jurkat T細胞は、3日ごとに予熱した培養培地に継代することで維持できる浮遊細胞株です。
アポトーシス細胞を90%のコンフルエントまで増殖させることによって調製し、継代後3〜4日かかります。このプロトコルに十分な数の細胞を得るために、5つのT75フラスコで細胞を増殖させます。細胞の準備ができたら、フラスコの内容物を約24ミリリットル吸引し、50ミリリットルの円錐形チューブに移します。トリパンブルー染色と血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
細胞を271倍gで5分間遠心分離してペレット化し、上清を廃棄します。次に、細胞を培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり300万個の細胞を取得します。ディッシュあたり5ミリリットルの細胞を移すことにより、細胞を100 x 20ミリメートルの組織培養皿に分注します。
約9つの培養皿を準備します。1つの皿を未露光のコントロールとして取っておき、残りの皿をUVに当てます。エネルギーボタンを押し、テンキーで「600」と入力して、UV架橋剤を正しいエネルギーレベルに設定します。対照を除くすべての皿に細胞を照射し、紫外線照射中は組織培養皿の上部カバーを必ず取り外します。
次に、すべての皿を細胞培養インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で4時間インキュベートします。インキュベーション後、照射したすべての細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに結合し、271倍gで5分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、細胞を24ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。チューブを再度遠心分離し、上清を取り除きます。