JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 5:37 分 • July 8th, 2025
刺激バッファーに懸濁された蛍光標識モノクローナル抗体を含む染色混合物を含むサイトメーターチューブを取ります。
濃度が低下する試験アレルゲンを複数のチューブに加えます。抗IgE抗体を1つのチューブに追加してIgEを介したポジティブコントロールとして機能し、陰性コントロールのために別のチューブにバッファーを追加します。
ヒト末梢血をチューブにピペットで入れます。インキュベート。
個人が試験アレルゲンに感作されている場合、この曝露により、アレルゲンは好塩基球表面のFc受容体に結合したアレルゲン特異的IgE抗体に結合します。
アレルゲンはIgE結合Fc受容体を架橋し、好塩基球の活性化を引き起こします。
好塩基球は脱顆粒を受け、炎症性メディエーターを含む細胞内顆粒を放出し、CD63 および CD203c 分子がアップレギュレーションされます。
蛍光標識モノクローナル抗体は、好塩基球上のCD63、CD203c、CCR3にそれぞれ結合します。
好塩基球の脱顆粒を止めるために温度を下げます。
バッファーを加えて赤血球を溶解し、細胞を固定します。
フローサイトメーターを使用して、リンパ球集団から好塩基球を特定します。
CD63を活性化マーカーとして使用し、アレルゲン濃度の低下による好塩基球の活性化を分析します。
まず、末梢血を 9 ミリリットルのヘパリン化チューブに採取し、サンプルをローターに入れて、実験プロトコルに必要になるまで室温に維持します。
ネガティブコントロールとポジティブコントロール用にそれぞれ2本の5ミリリットルサイトメーターチューブにラベルを付けます。また、テスト対象の異なるアレルゲンまたは薬物濃度について、それぞれ1本のチューブにラベルを付けます。次に、チューブが滑らずに完全にフィットするように、チューブをラックに置きます。
最初のポジティブコントロールについては、好塩基球の品質を確認するために、0.05%PBST中のN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)の4マイクロモル溶液を調製します。2番目のポジティブコントロールについては、PBSTを使用して1ミリリットルあたり0.05ミリグラムの抗IgE溶液を調製します。刺激バッファー20マイクロリットルあたり、CCR3-APC、CD203c-PE、およびCD63-FITC抗体をそれぞれ1マイクロリットル添加して、染色ミックスを調製します。次に、この染色混合物を各チューブに23マイクロリットル加えます。
100マイクロリットルのPBSTを陰性対照チューブに加え、100マイクロリットルのfMLPを一方の陽性対照チューブに加え、もう一方の抗IgEを100マイクロリットルに加えます。残りのチューブに、100マイクロリットルの異なるアレルゲンまたは薬物濃度を加え、摂氏37度で10分間インキュベートしま
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