磁性ガラス粒子による血液からの核酸抽出法

抽出

したてのヒト血液の入ったチューブを取り、溶解バッファーを加えます。

緩衝液中の界面活性剤は細胞膜を透過性化し、細胞を溶解し、細胞内核酸(NA)とヌクレアーゼを放出します。

緩衝液中のカオトロピック剤はヌクレアーゼを変性させ、NA分解を防ぎます。

磁性ガラス粒子またはMGP(シリカコーティングされた磁性粒子)を加え、完全に混合します。

バッファーの低pHはシリカをプロトン化し、MGPの表面に正電荷を帯

びます。

負に帯電したNAは、帯電した表面に静電的に結合し、NA-MGP複合体を形成します。

磁場下では、NA-MGP複合体がチューブの側面に集まります。

細胞破片やタンパク質を含む上清を廃棄します。

NA-MGP複合体を洗浄バッファーに再懸濁し、磁場を印加して複合体を回収し、残りの汚染物質とともに上清を廃棄することにより、複数の洗浄ステップを実行します。

溶出バッファーに複合体を再懸濁します。高いpHはNA-MGP相互作用を破壊し、NAを放出します。溶出したNAは、下流のアッセイの準備が整います。

採取した血液から核酸を精製するには、真空管を手で5〜10回ひっくり返して、チューブの内容物を再び混合します。調製したMGPのアリコートを採血管に直接注ぎ、未使用の採血管からサンプルが入ったチューブに新しい蓋を置きます。蓋に指を当ててチューブがしっかりと閉まっていることを確認し、チューブの内容物を5〜10回ひっくり返して混合します。

チューブを磁気ホルダーに入れ、蓋に指を当ててチューブがしっかりと閉じていることを確認します。次に、チューブ付きの磁気ホルダーを数回裏返して、磁石でチューブの側面に集まる前にMGPを分散させます。チューブの蓋を外し、使い捨てピペットを使用してチューブの内容物を50ミリリットルの収集チューブに捨てます。

準備したWB1のアリコートを採血管に直接注ぎ、チューブの蓋を閉めます。内容物を手で5〜10回混ぜます。次に、磁石を使用してチューブの側面にあるビーズを集め、先ほどのように液体を取り除きます。準備したWB2のアリコートにビーズを再懸濁します。次に、溶液を廃棄し、準備したWB3のアリコートで手順を繰り返します。

最後に、マグネットホルダーからチューブを取り外し、準備したEBのアリコートを採血管に直接注ぎます。チューブに蓋を置き、指で5〜10回軽くたたいてMGPを再懸濁します。最後に、1.5ミリリットルの使い捨てピペットを使用して、再懸濁したMGPの1滴を下流の核酸増幅反応混合物に移します。