担持脂質二重膜上におけるNK細胞免疫学的シナプス形成の超解像イメージング

脂質とビオチン化リン脂質で構成される支持脂質二重層(SLB)を備えたチャンバースライドを調製します。

ブロッキングタンパク質を添加して、非特異的相互作用を防ぎます。

ビオチン化リン脂質に結合するストレプトアビジンを導入します。

固定化ストレプトアビジンに結合するビオチン化蛍光標識抗CD16抗体を加えます。

D-ビオチンをピペットで投与して、ストレプトアビジンの細胞への非特異的結合を防ぎます。

ナチュラルキラー(NK)細胞を導入します。これらの細胞上のCD16受容体は、SLB結合抗CD16抗体に特異的に結合し、免疫シナプスを形成します。

この結合はアクチン再構成と微小管分極を引き起こし、最終的にはSLB結合抗CD16抗体とCD16受容体を含むシナプス中心にマイクロクラスターを形成します。

パーフォリンを含む溶解顆粒は、シナプスでアクチンフィラメントを分極して浸透します。

セルを修正します。膜とSLBを透過処理します。

チンフィラメントとパーフォリンにそれぞれ結合する蛍光標識ファロイジン抗体と抗パーフォリン抗体を追加します。

超解像蛍光顕微鏡を使用して、シナプスでの蛍光アクチンフィラメントとパーフォリン陽性顆粒の分布を視覚化します。

ガラス担持平面脂質二重層を組み立てるには、まず、ビーカーに30%の過酸化水素と硫酸を1対3の比率で混合して、100ミリリットルのピラニア溶液を調製します。この溶液に、2つの長方形の#1.5カバーガラスを20〜30分間置きます。カバーガラスを洗浄している間に、事前に調製した400マイクロモルのDOPC脂質のチューブ1本と、以前に調製した80マイクロモルのビオチン-PE脂質のチューブを1本取り出します。氷の上でアルゴンタンクに運びます。

新しい微量遠心チューブをアルゴンで脱酸素した後、DOPCとビオチン-PEを1対1の比率で加えます。比量は実験のニーズによって異なりますが、それぞれ少なくとも2マイクロリットルである必要があります。混合チューブと個々の試薬チューブを脱酸素してから、後者を冷蔵庫に戻します。

洗浄が終わったら、カバーガラスを蒸留水でよくすすいでください。カバーガラスを数分間自然乾燥させます。次に、1.5マイクロリットルのリポソーム混合物を抽出し、チャンバースライドのレーンチャンバーの1つに1滴ずつ分注します。レーンごとに 2 つのドロップを使用するのが一般的ですが、必須ではありません。

次に、乾いたカバーガラスを液滴の上にすばやく効率的に置きます。カバーガラスを置いた後に液滴が合わないように、液滴が十分な間隔にあることを確認してください。さらに、液滴がチャンバー壁の端に触れずに円形で明確に輪郭を保たれるようにしてください。カバーガラスとスライドの間の水密シールを確保するために、各レーンの間および周囲をしっかりと押し下げます。

マーカーペンを使用してドロップの位置に印を付けます。次に、100マイクロリットルの5%カゼイン水溶液をチャンバーに通し、二重層をブロックします。フローチャンバー内に気泡がないことを確認してください。次に、100マイクロリットルのストレプトアビジンを1ミリリットルあたり333ナノグラムの濃度で各レーンに注入します。

室温で10〜15分間インキュベートした後、1%ヒト血清アルブミンを含む3ミリリットルのHEPES緩衝生理食塩水を各レーンに通して洗浄し、過剰なストレプトアビジンを除去します。テキストプロトコルに記載されているように、以前に決定されたタンパク質濃度で100マイクロリットルのビオチン化蛍光標識抗CD16を追加します。

暗所で20〜30分間インキュベートした後、1%ヒト血清アルブミンを含む3ミリリットルのHEPES緩衝生理食塩水を各レーンに通して再度洗浄します。次に、過剰なストレプトアビジンに結合するために、濃度25ナノモルの100マイクロリットルのD D-ビオチンをチャンバーに流し、ストレプトアビジンが細胞に非特異的に結合する可能性を排除します。

次に、ヒトNK細胞をカウントし、1%ヒト血清アルブミンを含むHEPES緩衝生理食塩水に1ミリリットルあたり500,000の濃度で再懸濁します。D-ビオチンを、レーンあたり1%ヒト血清アルブミンを含むさらに3ミリリットルのHEPES緩衝生理食塩水でチャンバーから洗い流します。細胞を所望の濃度に再懸濁したら、各レーンに100マイクロリットルを加えます。チャンバーを摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーターに30〜60分間置きます。

このインキュベーション期間の後、細胞を室温で4%パラホルムアルデヒドで10〜20分間固定します。3ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を各レーンに流して洗浄し、パラホルムアルデヒドを除去します。次に、室温で30分間インキュベートする前に、400マイクロリットルのブロッキングバッファーを加えます。

次に、200マイクロリットルの希釈蛍光標識ファロイジンおよび蛍光標識抗パーフォリンモノクローナル抗体を添加して、F-アクチンとパーフォリンを染色します。室温で1時間インキュベートしてから、3ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水をチャンバーに流して洗浄します。チャンバーはイメージングの準備ができています。

まず、STED顕微鏡の必要なすべてのハードウェアモジュールの電源を入れます。画像解析ソフトウェアを起動し、共振スキャンモジュールとSTEDモジュールの両方を有効にします。これらの選択を行った後、ソフトウェアが起動するまで約3〜5分待ちます。

画面上部の [設定] タブをクリックします。[レーザー設定]を選択します。次に、白色光とSTED 592ナノメートルレーザーをオンにします。100倍の対物レンズを選択し、励起レーザービームを592ナノメートルの空乏レーザーに合わせます。[レーザー設定]モジュールを選択します。592 空乏レーザーをオフにし、660 ナノメートルの空乏レーザーをオン

スライドをステージのレンズの上に置きます。白色光ランプと接眼レンズを使用して、境界された二重層領域に結合した細胞に焦点を合わせます。次に、[構成] タブの右側にある [取得] タブに戻ります。[白色光に切り替える] タブをクリックし、そのモジュールの電源を入れ、励起レーザー ラインを適切な波長にドラッグします。

目的の検出器を選択し、検出範囲を設定した後、左側の集録ツールバーのシーケンシャルボタンをクリックして、左側のツールバーの下部にシーケンシャルスキャンダイアログを表示します。これにより、ユーザーは複数のシーケンスを追加でき、それぞれが異なる色に対して異なる励起ビームを持つことができます。フレーム間をクリックし、追加色ごとに励起周波数、検出器、検出範囲を設定します。すべての設定が最適化されたら、「開始」をクリックして取得プロセスを開始します。