担持脂質二重膜上におけるNK細胞免疫学的シナプス形成の超解像イメージング

リン

脂質とビオチン化リン脂質で構成される支持脂質二重層(SLB)を備えたチャンバースライドを調製します。

ブロッキングタンパク質を添加して、非特異的相互作用を防ぎます。

ビオチン化リン脂質に結合するストレプトアビジンを導入します。

固定化ストレプトアビジンに結合するビオチン化蛍光標識抗CD16抗体を加えます。

D-ビオチンをピペットで投与して、ストレプトアビジンの細胞への非特異的結合を防ぎます。

ナチュラルキラー(NK)細胞を導入します。これらの細胞上のCD16受容体は、SLB結合抗CD16抗体に特異的に結合し、免疫シナプスを形成します。

この結合はアクチン再構成と微小管分極を引き起こし、最終的にはSLB結合抗CD16抗体とCD16受容体を含むシナプス中心にマイクロクラスターを形成します。

パーフォリンを含む溶解顆粒は、シナプスでアクチンフィラメントを分極して浸透します。

セルを修正します。膜とSLBを透過処理します。

アク

チンフィラメントとパーフォリンにそれぞれ結合する蛍光標識ファロイジン抗体と抗パーフォリン抗体を追加します。

超解像蛍光顕微鏡を使用して、シナプスでの蛍光アクチンフィラメントとパーフォリン陽性顆粒の分布を視覚化します。

ガラス担持平面脂質二重層を組み立てるには、まず、ビーカーに30%の過酸化水素と硫酸を1対3の比率で混合して、100ミリリットルのピラニア溶液を調製します。この溶液に、2つの長方形の#1.5カバーガラスを20〜30分間置きます。カバーガラスを洗浄している間に、事前に調製した400マイクロモルのDOPC脂質のチューブ1本と、以前に調製した80マイクロモルのビオチン-PE脂質のチューブを1本取り出します。氷の上でアルゴンタンクに運びます。

新しい微量遠心チューブをアルゴンで脱酸素した後、DOPCとビオチン-PEを1対1の比率で加えます。比量は実験のニーズによって異なりますが、それぞれ少なくとも2マイクロリットルである必要があります。混合チューブと個々の試薬チューブを脱酸素してから、後者を冷蔵庫に戻します。

洗浄が終わったら、カバーガラスを蒸留水でよくすすいでください。カバーガラスを数分間自然乾燥させます。次に、1.5マイクロリットルのリポソーム混合物を抽出し、チャンバースライドのレーンチャンバーの1つに1滴ずつ分注します。レーンごとに 2 つのドロップを使用するのが一般的ですが、必須ではありません。

次に、乾いたカバーガラスを液滴の上にすばやく効率的に置きます。カバーガラスを置いた後に液滴が合わないように、液滴が十分な間隔にあることを確認してください。さらに、液滴がチャンバー壁の端に触れずに円形で明確に輪郭を保たれるようにしてください。カバーガラスとスライドの間の水密シールを確保するために、各レーンの間および周囲をしっかりと押し下