JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 2:40 分 • July 8th, 2025
ナチュラルキラー細胞またはNK細胞、および蛍光染色された標的細胞を含む細胞ペレットから始めます。
ペレットを適切な培地に再懸濁し、インキュベートします。
NK細胞は表面接着タンパク質を介して相互作用し、標的細胞と免疫シナプスを形成します。
これにより、NK細胞シグナル伝達が開始され、パーフォリンとグランザイムを含む細胞傷害性顆粒がシナプスに放出されます。
細孔形成タンパク質であるパーフォリンは、標的細胞の膜にチャネルを作成し、グランザイムが細胞質に入ることを可能にします。
セリンプロテアーゼであるグランザイムは、細胞内タンパク質と相互作用し、標的細胞のアポトーシス経路を活性化します。
次に、ヨウ化プロピジウム蛍光色素を加えます。
色素は損傷した膜を通って死細胞に入り、塩基対の間に挿入することでDNAに結合します。
その結果、死細胞は二重蛍光色素を発現し、生細胞は単一蛍光色素を発現します。
サンプルは、死細胞数と生細胞数を定量化することにより、NK細胞誘発性細胞毒性を評価するためのフローサイトメトリーの準備ができています。
細胞毒性アッセイサンプルを調製するには、まず、必要に応じて各サンプルおよび/または参加者の1.5ミリリットルチューブを標識し、NK細胞とDiO標識K562細胞の所望の比率を各チューブにピペットで入れます。
遠心分離によって細胞を収集し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に除去します。次に、細胞混合物を500マイクロリットルの不完全なNK細胞培地に再懸濁し、各チューブ内の細胞を5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムで標識します。
別の遠心分離で細胞を収集し、低温培養物を摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、同じ遠心分離条件下で細胞を遠心分離し、ペレットを25マイクロリットルの新鮮で完全なNK細胞培養培地に再懸濁します。