ヒト精密切片肺切片における化学的に誘発される細胞毒性を測定するためのアッセイ

ネイティブの肺の微細構造を維持する、精密にカットされたヒト肺スライスを含むマルチウェルプレートを取ります。

メディアを取り外します。増加する試験剤濃度をウェルに加え、インキュベートします。

その

細胞毒性の可能性に応じて、試験剤は細胞膜を破壊し、細胞死を誘発し、スライス内の生細胞を減少させます。

インキュベーション後、培地を取り除きます。水溶性テトラゾリウム塩(WST-1)と電子カップリング試薬を含む培地にスライスを浸

漬します。

インキュベート。代謝活性細胞では、原形質膜電子伝達系が細胞内NADHから細胞外電子カップリング試薬に電子を移動させ、細胞不透過性色素WST-1を安定した濃い黄色の水溶性ホルマザンに還元します。

インキュベーション後、プレートを振ってホルマザンを均一に分散させ、マルチウェルプレートに移します。

マイクロプレートリーダーを使用して、組織の生存率を示すホルマザンの吸光度を測定します。

試験薬の濃度に依存するホルマザン吸光度の低下は、肺スライスの生存率の低下を示し、試験薬の細胞毒性を確認します。

作業溶液のマスターミックスを調製するには、各ウェルに25マイクロリットルのWST-1試薬と225マイクロリットルの培地を希釈します。次に、各ウェルに250マイクロリットルのWST-1のマスターミックス作業溶液をピペットで移し、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション中は、PCLSがWST-1試薬で完全に覆

われていることを確認します。

その後、プレートを 200 rpm のオービタル シェーカーに置き、WST-1 試薬が完全に混合されるように 30 秒間慎重に振とうします。次に、24ウェルプレートの各ウェルから100マイクロリットルの上清を新しい平底96ウェルプレートに複製してピペットで移管します。マイクロプレートリーダーを使用して450ナノメートルで各ウェルの吸収を測定し、450ナノメートルでの吸収から630ナノメートルの基準で吸収を差し引きます。