乳酸デヒドロゲナーゼアッセイによる肺切片の細胞毒性と膜完全性の評価

マルチ

ウェルプレートで界面活性剤分子などの細胞毒性剤で処理したヒトの精密に切断された肺スライス(PCLS)から始めます。

界面活性剤は細胞の脂質二重層に挿入され、界面活性剤の疎水性尾部が脂質二重層の疎水性コアと相互作用します。

その結果、脂質分子の整然とした配置が妨げられ、ミセルの形成につながります。

これにより膜の完全性が損なわれ、細胞膜損傷の一般的な指標である乳酸デヒドロゲナーゼまたはLDHなどの細胞内内容物の漏出が引き起

こされます。

放出されたLDHを含む上清を回収します。

乳酸基質、NAD+、ジアホラーゼ、およびテトラゾリウム塩を含むLDHアッセイ反応カクテルを加え、インキュベートします。

LDHは乳酸をピルビン酸に酸化し、同時にNAD+補酵素をNADHに還元します。

ジアホラーゼは、NADHを利用してテトラゾリウム塩をホルマザン(着色された製品)に還元します。

界面活性剤誘発性細胞毒性は、ホルマザン産生によって示されるLDH活性から測定できます。

PCLSを試験剤の有無にかかわらずインキュベートした後、50マイクロリットルの上清と複製を新しい96ウェルプレートに移します。これにより、24ウェルプレートの処理された各ウェルから複製が生成されます。

アッセイの直前に、96ウェルプレート用に125マイクロリットルの触媒溶液と6.25ミリリットルの色素溶液を完全に混合することにより、LDH試薬の作業溶液のマスターミックスを調製します。次に、50マイクロリットルのマスターミックス作業溶液をすでに50マイクロリットルの上清を含む各ウェルにピペットで入れ、プレートを室温で暗所で20分間インキュベートします。その後、マイクロプレートリーダーを使用して492ナノメートルでの各ウェルの吸収を測定し、492ナノメートルでの吸収から630ナノメートルの基準での吸収を差し引きます。