ゼブラフィッシュ幼生の真菌感染を定量化する技術

後脳室に真菌胞子を注射したゼブラフィッシュの幼虫を取ります。

マクロファージは注射部位に動員され、胞子の周りにタイトなクラスターを形成します。

胞子はマクロファージによる食作用の飲み込みを受けます。

これらの胞子はファゴソーム内の分解に抵抗する能力があり、菌糸に発芽してマクロファージの壊死性細胞死を誘発します。

菌糸は、その表面に露出した病原体関連分子パターン(PAMP)を持っています。

感染部位に動員された好中球は、PAMPを認識して結合します。好中球との接触は、菌糸の複雑な超分岐表現型を引き起こし、それによって好中球による好中球の飲み込みを妨げ、免疫回避を促進します。

幼虫を均質化し、生存可能な真菌の胞子と菌糸を放出します。遠心分離して細胞破片を除去し、上清を増殖培地にプレーティングします。

インキュベーション時に、真菌コロニー形成単位またはCFUを数えます。

CFU数は、宿主の免疫防御を回避した生存可能な真菌胞子の数を表します。

注射直後に、幼虫8匹を個々の1.7ミリリットルのチューブに移し、安楽死させます。アンピシリンとカナマイシンを含む1ミリリットルのPBSを調製します。幼虫の入ったチューブからできるだけ多くの液体を取り除きます。次に、抗生物質を含む90マイクロリットルのPBSを加えます。

組織ライザーで幼虫を毎分1,800振動で6分間均質化します。次に、それらを17,000回gで30秒間回転させます。均質化された懸濁液を各チューブからラベル付けされたGMMプレートの中央までピペットで移動させ、リムに広がらないように注意しながら、使い捨てのL字型スプレッダーを使用して広げます。プレートを摂氏37度で逆さまにして2〜3日間インキュベートします。次に、形成されたコロニーの数を数えます。