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正確な追跡のために独自の蛍光マーカーでタグ付けされた蛍光標識免疫細胞を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫から始めます。
幼虫は、アスペルギルス胞子を発現する赤色蛍光タンパク質を後脳に事前に注入されます。
後脳内では、真菌の胞子が局所的な炎症を模倣し、マクロファージを含む免疫細胞を引き付け、マクロファージは胞子を食って
除去します。少数の胞子が持続して菌糸に発芽し、病原体由来の分子を放出し、好中球を感染部位に引き寄せます。
麻酔をかけた幼虫を、成長およびイメージング用のゼブラフィッシュの傷跡および捕獲装置、または制限チャネルを介して傷跡チャンバーに相互接続されたzWEDGI装置の培地含有ローディングチャンバーに移します。
後脳イメージングのために、制限チャネル内に幼虫を背側方向に固定します。
初期段階では、赤色蛍光は真菌胞子を表し、緑色蛍光は感染部位へのマクロファージの動員を確認します。
時間の経過とともに、赤色蛍光の広がりは感染の進行を意味し、追加の青色蛍光の出現は好中球の動員を示します。
イメージング当日、100マイクロモルPTUを含む3.5ミリメートルのシャーレを1つ、E3-トリカインを含む1つを準備します。E3-トリカインをzWEDGIデバイスのチャンバーに追加し、P100マイクロピペットを使用してチャンバーと拘束チャネルから気泡を除去し、チャンバーの外側にある余分なE3-トリカインをすべて除去します。
1匹の幼虫をピペットで汲み上げ、E3 PTUで皿に移し、次に、できるだけ少ない液体でE3-トリカインに移します。30秒後、麻酔をかけた幼虫を創傷および閉じ込め装置のローディングチャンバーに移します。
E3-トリカインを創傷チャンバーから取り出し、幼虫の尾を制限チャネルに移動させるためにローディングチャンバーに放出します。後脳を逆対物レンズで画像化できるように、幼虫が外側、背側、または背外側に配置されていることを確認してください。
共焦点顕微鏡で幼虫をイメージングした後、E3-トリカインを創傷チャンバーに放出し、幼虫を拘束チャネルからローディングチャンバーに押し込みます。幼虫を拾い上げてE3-トリカインで皿に戻し、次に、できるだけ少ない液体でE3 PTUで皿に移します。PTUですすぎ、48ウェルプレートに戻します。