抗カプセル抗体によるカプセル化細菌のオプソニン化を評価するためのオプソノアドヒアランスアッセイ

化学的に死滅し、蛍光標識された炭疽菌の懸濁液を取ります。

主にポリガンマグルタミン酸で構成される細菌カプセルは、食作用に対する保護を提供します。

体タンパク質を破壊するために熱不活化された非ヒト霊長類血清を取ります。細菌カプセルベースのワクチンで免疫された動物から単離されたこれらの血清には、抗カプセル抗体が含まれています。

化学的に死滅した細菌懸濁液を血清に加えます。抗体は細菌カプセルに特異的に結合し、細菌のオプソニン化を促進し、食作用細胞による除去のために抗体をマークします。オプソニン作用を高めるために標準的な補体タンパク質を添加します。

オプソニン化細菌を付着マクロファージ(食細胞)に移します。短時間インキュベートします。

細菌上の抗体と補体タンパク質は、それぞれマクロファージFc受容体と補体受容体に結合し、細菌の付着を促進します。

メディアを取り外します。緩衝液で洗浄して、付着していない細菌を除去します。

細胞の完全性を維持するために細胞を固定します。

蛍光染色を使用してマクロファージを標識します。

蛍光顕微鏡を用いて、蛍光マクロファージに付着した蛍光菌を観察し、抗カプセル抗体による効果的な細菌オプソニン化を確認します。

不活化した細菌ストックをPBSで3回洗浄して固定剤を除去します。FITC 溶液を 75 マイクログラム/ミリリットルの最終濃度で添加します。ゆっくりと、混合物を摂氏4度で18〜24時間攪拌します。以前と同じように細菌を洗浄して、余分なFITCを取り除きます。

最終洗浄後、同じ開始容量でPBS中の桿菌を再懸濁します。分注し、使用するまで-20°Cで保存します。ヒト以外の霊長類からの少量の試験血清を、ヒートブロックまたはPCR装置で摂氏56度で30分間熱不活化します。FITC標識細菌を解凍し、PBSで2回、15,000回gで3〜5分間ペレット化して洗浄します。同じ開始ボリューム内のPBSに再懸濁します。

96ウェルの丸底プレートで、試験血清を細胞培地で連続希釈します。別の96ウェル丸底プレートで、10マイクロリットルの希釈試験血清を各ウェルに加えます。次に、再構成したばかりの赤ちゃんウサギの補体を10マイクロリットル加えます。

プレート番号3には、感染の多重度を20にする適切な量のFITC標識桿菌を、例えば、50,000細胞に対して50,000×20の桿菌を含む容量で加えます。プレート番号3の各ウェルに、合計105マイクロリットルの適切な量の細胞培地を補充します。プレート番号3を摂氏37度で、湿度5%CO2の存在下で30分間インキュベートし、桿菌をオプソニン化します。

接着細胞を含むプレート番号1を摂氏37度のヒートブロックに置きます。マルチチャンネルピペッターを使用して使用済み培地をウェルから除去し、プレート番号3から100マイクロリットルのオプソニン化細菌にすばやく交換して、ピペッティング中にウェルに気泡が発生しないようにします。細胞単層を乱さないように、ウェルの側面に体積を追加します。

プレート番号1を摂氏37度で5%CO₂および湿度で30分間インキュベートして接着させます。摂氏37度のヒートブロックの上に150マイクロリットルのPBSで各ウェルを5回洗浄し、付着していない桿菌を除去します。洗浄中に細胞が誤って分散しないように、ウェルの側面にピペットを移します。各ウェルに150マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加え、細胞を1時間固定します。

細胞をPBSで2回洗浄した後、2マイクロリットルの高含有量スクリーニングオレンジ色細胞染色剤を10ミリリットルのPBSに混合します。次に、この染色液150マイクロリットルを固定細胞に加え、周囲温度で30分間インキュベートします。プレート番号1をステージに置き、明視野または位相差を使用して細胞に焦点を合わせます。

Acquisition]タブで、プレート設定として[96-Well format]を選択し、[Channel settings]を選択します。次に、[タイルモードに設定]を選択します。取得する画像の数を示します。取得モードを白黒 またはモノクロに変更し、ビニングを少なくとも2 x 2に設定します。オートフォーカスまたはフォーカスモジュールをオンにします。オートフォーカス機能を実行する頻度を示します。

次に、zスタック機能をオンにして、細胞単層と付着桿菌の厚さをキャプチャするzスタックの数を示します。画像を保存するファイルフォルダを指定します。次に、自動イメージングプログラムを実行します。テキストプロトコルで説明されているように、データの収集と分析を実行します。