光活性化ペプチドMHCによる制御されたT細胞活性化の評価

カバーガラスをビオチン化ポリ-L-リジンでコーティングして、ビオチンが豊富な表面を作成します。

次に、ビオチンに結合し、その後の相互作用のための分子架け橋を形成するタンパク質であるストレプトアビジンを導入します。

その後、主要な組織適合性複合体(接着分子とともにpMHC)に結合したビオチン化フォトケージングペプチドを追加します。

ビオチン化されたpMHCリガンドと接着分子は、ストレプトアビジンの特定の領域と相互作用し、それらの固定化を可能にします。

次に、カバーガラスを緩衝生理食塩水で繰り返し洗浄し、T細胞を導入します。

ペプチド上の特定の残基に繋がれた感光性化学基であるフォトケージの存在は、T細胞受容体のペプチドへの自発的な結合を妨げます。

制御されたT細胞の活性化のために、フォトケージされたペプチドを紫外線にさらします。

紫外線はフォトケージとペプチド複合体の間の化学結合を切断し、ペプチドの天然形態を露出させます。

T 細胞受容体は露出したペプチドを識別して結合し、インテグリンは接着分子に結合して T 細胞の活性化を引き起こします。

、ビオチン化ポリ-L-リジンまたはバイオPLLを蒸留脱イオン水で1〜500に希釈して、8ウェルチャンバーカバーガラス8個に加えます。室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、蒸留脱イオン水で洗浄し、室温で2時間乾燥させます。

2% BSAを含むHEPES緩衝生理食塩水からなるブロッキングバッファーで、室温で30分間、バイオPLLコーティングされた表面をブロックします。インキュベーション後、ウェルを乾燥させずに、バイオPLLでコーティングされた表面からブロッキングバッファーを除去します。次に、ストレプトアビジンを加え、摂氏4度でインキュベートします。

1時間後、コーティングされた表面をHBSで洗浄します。チャンバースライドウェルを4〜5回充填して反転させ、ウェルからHBSを取り除きます。井戸を乾燥させないでください。

CD4陽性T細胞またはCD8陽性細胞のいずれかの特定のビオチン化光活性化ペプチド主要組織適合性複合体リガンドおよび接着分子をバイオPLLコーティングされた表面に添加します。光から保護し、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、以前と同じように洗浄し、播種の準備が整うまでHBSに残します。最後に、適切なTCRを発現する200,000個のCD4陽性またはCD8陽性T細胞を正しいウェルに加え、細胞を摂氏37度で15分間付着させます。

細胞が表面に付着して広がると、光活性化とイメージングの準備が整います。画像取得には、UV対応の150倍対物レンズを備えた倒立全反射蛍光顕微鏡を使用します。それぞれ488ナノメートルと561ナノメートルの励起レーザーを使用して、緑色と赤色の両方のチャネルでプローブを監視します。

T細胞を含むチャンバースライドを取り付けた後、必要に応じて顕微鏡の設定を調整して、TIRFまたは落射蛍光照明を取得します。ライブモードでは、目的の蛍光プローブを発現している細胞のフィールドを選択します。ソフトウェア制御を使用して、個々の細胞の下に光活性化のためのミクロンスケールの領域を確立します。次に、取得を開始します。

通常、80 個の時間点がそれぞれ 5 秒の間隔で取得されます。これにより、デュアルカラー実験の場合、488ナノメートルと563ナノメートルの連続露光のための時間が残されます。次に、10個のタイムポイントを取得した後、デジタル絞りシャッターを1〜1.5秒間開いて、選択した領域をフォトアクティベートします。タイムラプスが完了したら、セルの新しいフィールドを選択し、このプロセスを繰り返します。