抗体の生体内分布を研究するためのin vivo免疫蛍光ローカリゼーション法

乳がんのマウスモデルを取り上げます。乳腺腫瘍は、がん細胞、がん関連線維芽細胞、脂肪細胞、免疫細胞、および腫瘍血管系で構成されます。

蛍光色素結合腫瘍特異的抗体を静脈内注射します。

腫瘍血管系に到達すると、抗体は血管内皮および近くのがん細胞上の腫瘍特異的膜貫通タンパク質に結合します。

腺を外科的に分離し、凍結媒体に浸します。

スライド上の凍結切片を取得し、バッファーですすぎ、凍結培地を除去します。

組織構造を維持するために切片を固定します。免疫染色を強化するための界面活性剤と、非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を塗布します。

血管内皮上の接着分子に特異的な一次抗体と、一次抗体に結合して血管系を標識する蛍光色素結合二次抗体を導入します。

スライドに封着剤を追加し、カバーガラスを置きます。

共焦点顕微鏡下で、蛍光標識された腫瘍血管系内およびその周囲の腫瘍特異的抗体の生体内分布を評価します。

テキストプロトコルに記載されているように麻酔に続いて、抗体溶液の尾静脈接種の準備をします。アルコールワイプで3回拭いて動物の尻尾を消毒します。ヒートパッドで約30秒間温めて尾静脈を拡張します。動物全体を加熱しないでください。27 ゲージのテールベーン カテーテルを使用して、バタフライ針を 2 つの外側尾静脈のうちの 1 つに挿入します。

カテーテルへの血液の逆流を視覚化して、溶液が尾に捕らえられるのではなく、動物に完全に入るように針が適切に配置されていることを確認します。

サージカルテープを使用して、挿入した針でテールをステージに慎重に固定します。25マイクロリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水でカテーテルを洗い流します。次に、インスリン注射器を使用して抗体溶液をカテーテルに注入します。カテーテルを25マイクロリットルの滅菌PBSでもう一度洗い流します。尾から針を外し、圧力をかけて出血を止めます。

テキストプロトコルに記載されているように、マウスの人道的な安楽死を行い、マウスを仰臥位に置きます。手術用はさみと鉗子を使用して腫瘍組織を切除します。鉗子を使用して、尾に最も近い乳腺のセットの間の皮膚の外層のみをつかみ、手術用ハサミで小さな切開を行います。閉じたハサミを切り口に挿入し、先端をゆっくりと開き、皮膚を下にある腹壁膜から慎重に分離し、無傷のままにします。

腹部を垂直に切開し、皮膚を内膜から分離し続けます。3番目と4番目の乳腺の間に、腹部を横切って水平に切り込みを入れ、皮膚の収縮と乳腺の視覚化を可能にします。鉗子で各腫瘍または正常腺をつかみ、手術用ハサミを使用して付着した皮膚を慎重に切り取ります。

切除した組織を、事前にラベル付けされ、最適な切断温度包埋培地で満たされた組織使い捨てベースモールドに入れます。ドライアイスの上に置いて型をすばやく凍結します。オフターゲット送達を研究するには、関心のある他の組織または臓器を切除します。クライオスタットを使用して、凍結組織ブロックを10ミクロンの厚さで切片し、隣接する切片を事前に標識された接着スライドガラスに配置します。

凍結組織スライドを室温PBSで5分間すすぎ、包埋培地を除去します。疎水性バリアペンで組織切片を区切って、染色中に必要な溶液の量を減らします。組織切片を4%パラホルムアルデヒド溶液で5分間固定します。スライドをPBSで5分間すすぎた後、PBS中の0.5%Triton X-100で組織切片を15分間透過処理します。スライドをPBSで5分間再度すすぎます。

%の重量/体積のウシ血清アルブミンおよび5%の体積/体積のヤギ血清を含むPBSで組織を室温で1時間ブロックします。スライドをPBSで5分間すすぎた後、一般的な核、血管、または細胞質マーカーなどの記録保持一次抗体とともに切片をインキュベートします。ここで、ラット抗マウスCD31をブロッキング溶液中で1〜100希釈で用いる。一次抗体を含むスライドは、スライドトレイ上で脱水から保護され、摂氏4度で一晩放置されます。

インキュベーション後、スライドをPBSで5分間3回すすぎます。PBSは毎回変更してください。スライドを二次抗体とともにインキュベートして、一次抗体を標識します。このアプリケーションでは、AlexaFluor-546 結合ヤギ抗ウサギ抗体を使用して抗 B7-H3 抗体を視覚化し、ブロッキング溶液中の AlexaFluor-488 ヤギ抗ラット二次抗体を使用して CD31 を視覚化します。スライドを光や脱水から保護し、スライドトレイ上で室温で1時間放置します。

スライドをPBSですすぐ後、以前と同様に、組織スライスの中心に封入剤を1滴塗布します。気泡が閉じ込められないように、カバーガラスを慎重に配置します。カバーガラスの端を透明なマニキュアで密封し、乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡イメージングと定量画像解析を続行します。