ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

ヒト白血球懸濁液を含むマルチウェルプレートを取ります。FITC標識病原性真菌胞子を追加します。

インキュベーション中、胞子は膨潤して硬い疎水性タンパク質層を破壊し、食細胞上の特定のパターン認識受容体によって認識される細胞壁多糖類を露出させます。

この結合は細胞内シグナル伝達経路を誘発し、ファゴソーム内でのアクチン再構成と胞子の内在化を引き起こします。

食細胞の活性化状態に応じて、一部の胞子は内在化せずに細胞に付着したままになります。

インキュベーション後、細胞を回収し、新鮮なチューブに移します。

遠心機。細胞をバッファーに再懸濁し、マルチウェルVボトムプレートに移します。

接着胞子上の露出したFITC分子に結合し、対比染色する蛍光色素標識抗FITC抗体を導入します。

遠心機。細胞をバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターチューブに移します。

フローサイトメトリーを実行して、内在化胞子と細胞接着胞子を区別します。

内在化された胞子を含む食細胞はFITCシグナルを示し、接着胞子を持つ細胞はFITCおよび対比染色シグナルを示します。

まず、10%FCSを添加した1.5ミリリットルのRPMI中の200万個の白血球と400万個のFITC標識分生子を12ウェル培養プレートに移します。分生子のない細胞のみのコントロールと、標識されていない分生子を持つ細胞のコントロールを含めます。プレートを摂氏37度の加湿二酸化炭素インキュベーターで所望の時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞スクレーパーを使用して細胞を回収し、15ミリリットルのチューブに移します。

まず、各サンプルとコントロールを100マイクロリットルを96ウェルV底プレートの1つのウェルに入れます。洗浄用に2ミリモルのEDTAを含む150マイクロリットルのPBSを加えます。色補正のために、各色の分生子のない100万個の細胞をプレートの他のウェルに配置します。濾さずに残される細胞の井戸を含めます。洗浄のために、2ミリモルのEDTAを含む150マイクロリットルのPBSを各ウェルに加えます。

次に、プレートを粘着ホイルで覆い、室温で300倍gで5分間遠心分離します。次に、ホイルを取り除き、プレートをシンクまたは使い捨てペーパータオルの上に一度だけ素早く力強く反転させて、上清を捨てます。細胞を100マイクロリットルの抗体混合物に再懸濁し、ピペッティングでよく混合します。

色を補正するには、2ミリモルのEDTAを含む100マイクロリットルのPBSにそれぞれの細胞を再懸濁し、抗体ミックスで使用したのと同じ量で1種類の抗体を各ウェルに加えます。粘着ホイルで覆い、室温で暗所で20分間インキュベートします。

この後、ホイルを取り除き、2ミリモルのEDTAを含む150マイクロリットルのPBSを各ウェルに加えて洗浄