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ヒト白血球懸濁液を含むマルチウェルプレートを取ります。FITC標識病原性真菌胞子を追加します。
インキュベーション中、胞子は膨潤して硬い疎水性タンパク質層を破壊し、食細胞上の特定のパターン認識受容体によって認識される細胞壁多糖類を露出させます。
この結合は細胞内シグナル伝達経路を誘発し、ファゴソーム内でのアクチン再構成と胞子の内在化を引き起こします。
食細胞の活性化状態に応じて、一部の胞子は内在化せずに細胞に付着したままになります。
インキュベーション後、細胞を回収し、新鮮なチューブに移します。
遠心機。細胞をバッファーに再懸濁し、マルチウェルVボトムプレートに移します。
接着胞子上の露出したFITC分子に結合し、対比染色する蛍光色素標識抗FITC抗体を導入します。
遠心機。細胞をバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターチューブに移します。
フローサイトメトリーを実行して、内在化胞子と細胞接着胞子を区別します。
内在化された胞子を含む食細胞はFITCシグナルを示し、接着胞子を持つ細胞はFITCおよび対比染色シグナルを示します。
まず、10%FCSを添加した1.5ミリリットルのRPMI中の200万個の白血球と400万個のFITC標識分生子を12ウェル培養プレートに移します。分生子のない細胞のみのコントロールと、標識されていない分生子を持つ細胞のコントロールを含めます。プレートを摂氏37度の加湿二酸化炭素インキュベーターで所望の時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞スクレーパーを使用して細胞を回収し、15ミリリットルのチューブに移します。
まず、各サンプルとコントロールを100マイクロリットルを96ウェルV底プレートの1つのウェルに入れます。洗浄用に2ミリモルのEDTAを含む150マイクロリットルのPBSを加えます。色補正のために、各色の分生子のない100万個の細胞をプレートの他のウェルに配置します。濾さずに残される細胞の井戸を含めます。洗浄のために、2ミリモルのEDTAを含む150マイクロリットルのPBSを各ウェルに加えます。
次に、プレートを粘着ホイルで覆い、室温で300倍gで5分間遠心分離します。次に、ホイルを取り除き、プレートをシンクまたは使い捨てペーパータオルの上に一度だけ素早く力強く反転させて、上清を捨てます。細胞を100マイクロリットルの抗体混合物に再懸濁し、ピペッティングでよく混合します。
色を補正するには、2ミリモルのEDTAを含む100マイクロリットルのPBSにそれぞれの細胞を再懸濁し、抗体ミックスで使用したのと同じ量で1種類の抗体を各ウェルに加えます。粘着ホイルで覆い、室温で暗所で20分間インキュベートします。
この後、ホイルを取り除き、2ミリモルのEDTAを含む150マイクロリットルのPBSを各ウェルに加えて洗浄します。プレートを再び粘着ホイルで覆います。300 g で室温で 5 分間遠心分離し、ホイルを取り除き、プレートをシンクまたは使い捨てペーパータオルの上に素早く力強く反転させて上清を捨てます。細胞を2ミリモルEDTAを含む200マイクロリットルのPBSに再懸濁し、各ウェルから細胞懸濁液を別々の丸底チューブに移します。
フローサイトメーターを始動し、温めます。取得ソフトウェアで、新しい実験を作成し、新しいサンプルをセットアップしてラベル付けします。テキストプロトコルに概説されているように、適切な蛍光色素のパラメーターと検出器を設定します。
このソフトウェアでは、テキストプロトコルで概説されているように、適切なドットプロットを表示します。細胞のみのサンプルを使用して、いくつかの細胞を取得し、白血球の周囲にゲートを設定します。白血球ゲートに基づいて、SSC/CD45プロットで分生子から分離するためのCD45陽性細胞のゲート。ドットプロットCD14/CD66bでは、好中球と単球を別々にゲートします。
この後、細胞のみのサンプルから標識されていない分生子に変更します。ドットプロットでは、抗FITC/FITCは好中球を表示し、抗FITCおよびFITCシグナルの象限を設定します。統計ビューを開き、象限を調整して、象限 Q1、Q2、および Q4 のセルを最大 1% 許可します。
単球ゲートに対してこのプロセスを繰り返します。白血球ゲートで、少なくとも20,000イベントを含むすべてのサンプルを記録します。ヒト好中球によるFITC標識分生子の食作用は、統計ビューから読み取ることができます。