哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量のための免疫蛍光アッセイ

カバーガラスに付着した骨肉腫細胞を含むマルチウェルプレートを取ります。

これらの骨がん細胞はストレス誘発性化学物質で前処理され、ストレス顆粒が形成されます。

ストレス顆粒は、非翻訳mRNA、小さなリボソームサブユニット、RNA結合タンパク質(RBP)、翻訳関連因子、およびシグナル伝達タンパク質を含む細胞質膜のない細胞小器官です。

培地を廃棄し、細胞をバッファーで洗浄します。細胞の形態を維持するために細胞を固定します。

細胞を透過処理して細胞内標的にアクセスします。ブロッキングタンパク質を添加して、非特異的抗体の結合を防ぎます。

ストレス顆粒内の特定のRBPおよび翻訳関連因子に結合する一次抗体を導入します。

異なる蛍光色素標識二次抗体およびヘヒスト色素でインキュベートします。

二次抗体はストレス顆粒関連タンパク質に結合した一次抗体に結合し、ヘヒスト分子はDNAを染色します。

細胞を含むカバーガラスを、取り付け媒体を使用して取り付けます。

蛍光顕微鏡を使用して、細胞を観察して、関連タンパク質の共局在を特徴とする蛍光病巣として現れるストレス顆粒を視覚化および定量化します。

細胞を固定するには、ウェルから培地を取り出し、約250マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。約250マイクロリットルの緩衝4%パラホルムアルデヒド溶液を加えて細胞を固定し、カバーガラスの上部が完全に覆われていることを確認します。次に、プレートを室温のベンチロッカーに15分間置きます。次に、パラホルムアルデヒドを取り除き、適切に廃棄します。

約250マイクロリットルの氷冷メタノールを加えて、細胞を透過処理して平らにします。プレートをロッカーの上で室温でさらに5分間インキュベートします。透過処理が完了したら、メタノールを廃棄し、約250マイクロリットルのブロッキングバッファーを室温で1時間塗布して細胞をブロックします。次に、G3BP1、eIF4G、およびeIF3bに対する抗体12マイクロリットルを3ミリリットルのブロッキングバッファーに添加して、一次抗体溶液を調製します。

250マイクロリットルの抗体溶液を24ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートをロッカー上で室温で少なくとも1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、抗体溶液を取り出し、細胞を約250マイクロリットルのPBSで5分間洗浄します。次に、12マイクロリットルの抗マウスCy2、抗ウサギCy3、および抗ヤギCy5抗体を3マイクロリットルのヘクスト色素とともに3ミリリットルのブロッキングバッファーに加えて、二次抗体溶液を調製します。

各ウェルに250マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、プレートを覆ってサンプルを光から保護します。プレートをロッカー上で室温で1時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、抗体溶液を取り出し、PBSで細胞を5分間洗浄します。粘度を下げるために、摂氏37度のヒートブロックに10分間加熱します。次に、事前にカットされた200マイクロリットルのピペットチップを使用して、25マイクロリットルの封入剤をラベル付きのスライドガラスに置きます。

細い鉗子を使用して、カバーガラスをウェルからスライドに移し、細胞が封入培地に面するように上部を反転させます。清潔なP200チップを使用して、カバースリップを押し下げます。すべてのカバーガラスが取り付けられたら、実験用組織をスライドにしっかりと押し付けて、余分な封入剤を取り除きます。その後、スライドを水で洗い流し、すぐにもう一度ラボティッシュで吸い取ります。