顆粒球および単球における食作用および酸化的バースト活性を評価するためのアッセイ

赤血球(赤血球)を含むヒト全血、白血球(単球や顆粒球などの白血球、その他の血球)を含むチューブから始めます。

ジヒドロエチジウム(スーパーオキシド指示薬)と標識されていない細菌を1つのチューブに導入します。もう一方のチューブを緑色の蛍光色素標識細菌で処理します。

顆粒球と単球は細菌の病原体関連分子と相互作用し、ファゴソーム内にそれらを飲み込みます。

これにより、ファゴソーム膜酵素NADPHオキシダーゼが活性化され、分子状酸素がスーパーオキシドアニオンに還元されます。

スーパーオキシドアニオンはさらに過酸化水素(活性酸素種、またはROS)を生成し、酸化バーストを引き起こします。

ファゴソーム内で、ROSはジヒドロエチジウムを酸化して2-ヒドロキシエチジウムを形成し、細菌のDNAを染色して赤色蛍光を与えます。

細胞外蛍光を消光するために、クエンチャーを導入します。

溶解

液を加えて、潜在的な赤血球干渉を排除し、白血球を固定します。

フローサイトメトリーでは、緑色の蛍光を持つ細胞は顆粒球と単球の食作用を確認し、別の管に赤色の蛍光を持つ細胞はこれらの細胞の酸素バースト活性を示します。

手順を開始する前に、製造元の指示に従って、血液分析装置を使用して、血液サンプルの白血球鑑別分析を伴う全血球計算を実行します。ミリリットルあたりの細胞単位の白血球数と、サンプルの好中球と単球の割合値をメモします。

次に、各実験チューブと対照チューブについて、延長された長さのピペットチップを使用して、各全血サンプル100マイクロリットルをリチウムヘパリン採血管から適切に標識された12×75ミリメートルのチューブの底に移します。すべての血液が移されたら、HEコントロールチューブを含む赤インクとHでラベル付けされたチューブに10マイクロリットルのHE作業溶液を加え、チューブにキャップをします。

サンプルを短時間ボルテックスし、チューブを開いた金属ラック内の摂氏37度のウォーターバスに移し、5分ごとに穏やかに振とうします。15分後、ラックとチューブを氷水浴に12分間、5分ごとに軽く振とうとすばやく移します。

インキュベーションの最後に、HEコントロールチューブを含む、赤インクとHで標識されたチューブに、適切な量の非標識黄色ブドウ球菌作業溶液を加えます。キャップでチューブを短時間渦にします。次に、FITCコントロールチューブを含む黒インクとFで標識されたチューブに適切な量のFITC標識黄色ブドウ球菌作業溶液を加え、サンプルを短時間ボルテックスします。

次に、すべてのチューブを摂氏37度の水浴で5分ごとに振とうしながら20分間インキュベートし、続いて氷水で1分間冷却します。サンプルを室温に置いた後、リピーターピペットを使用して100マイクロリットルの氷冷クエンチ溶液をすべてのチューブに加え、サンプルを