ヒト粘膜内層液中の免疫メディエーターレベルの定量化

吸収された鼻粘膜内層液を含む濾紙を氷上で解凍し、サンプルの劣化を防ぎます。

この液体は、ケモカインやサイトカインなどの免疫メディエーターで構成されています。

濾紙を緩衝液に浸します。内容物をチューブフィルターに移します。遠心分離機でろ紙から粘膜内層液を溶出します。

ろ過した鼻抽出物を、メディエーター特異的捕捉抗体の配列でパターン化されたアッセイプレートに加えます。

免疫メディエーターは、対応する抗体に結合します。

それぞれのメディエーターに結合するルテニウム錯体で標識された検出抗体を導入します。

トリプロピルアミン(TPA)を含むトリスベースのバッファーを追加します。

電極全体に電位が印加されると、ルテニウム錯体とTPAが酸化されます。

得られたTPAラジカルはルテニウム錯体を励起します。

基底状態に戻ると、ルテニウム錯体は光子を放出します。

測定された光強度は、粘膜内層液中の特定の免疫メディエーター濃度に比例します。

気道免疫メディエーターの定量化では、摂氏マイナス80度の保管場所から最大10個のサンプルを氷上に置き、それらの識別番号を記録します。サンプルが解凍したら、被験者ごとに両方の濾紙を、濾紙あたり150マイクロリットルの新しく調製した緩衝液に

浸します。

緩衝原液25ミリリットルあたり1錠の完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤を補充します。サンプルをプレートシェーカーに400 RPMで5分間移します。バッファーとろ紙を個々の酢酸セルロースチューブフィルターのカップに移します。

サンプルを遠心分離して、ろ過された鼻抽出物を微量遠心チューブの底に集めます。次に、カップを取り外し、チューブを氷の上に置きます。次に、鼻抽出物の150マイクロリットルのアリコートを低タンパク質結合保存プレートの個々のウェルに移し、分析までプレートを摂氏負80度で保存します。次に、標準的なアッセイプロトコルに従って、高感度電気化学発光ベースのマルチプレックスアレイによって、目的の鼻免疫メディエーターの濃度を測定します。