プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

膜貫通スパイク蛋白質を持つエンベロープウイルスは蛋白質分解切断部位を有

する

宿主細胞上の膜結合プロテアーゼはスパイクタンパク質を切断し、ウイルスの侵入を促進する融合ペプチドを露出させます。

まず、標準的な切断部位を持つ野生型ペプチドと、それぞれが部位に固有の変異を持つ変異型ペプチドを取ります。

蛍光ペプチドには、蛍光色素とクエンチャーが含まれています。近接しているため、クエンチャーは蛍光色素の蛍光を吸収します。

アッセイバッファーと宿主プロテアーゼを含む氷上のマルチウェルプレートを取ります。

野生型ペプチドとバリアントペプチドを別々のウェルに追加します。最適なプロテアーゼ活性を得るために適切な温度でインキュベートします。

プロテアーゼはペプチドを切断し、クエンチャーを蛍光色素から分離し、蛍光発光を可能にします。

蛍光シグナルの変化を測定して、タンパク質分解切断速度を決定します。

野生型配列の速度が高いほどタンパク質分解活性が高いことを示し、バリアントの速度が低いほど切断効率が変化していることを示します。

テキストプロトコルに記載されているように、プロテアーゼに適切なアッセイバッファーを調製し、バッファーを氷上で冷却します。固体の黒色ポリスチレン未処理の平底96ウェルプレートを氷の上に置き、その下に薄い金属プレートを置き、冷却と安定性をサポートします。

隣接する

ウェルからの蛍光漏れを防ぐために、アッセイプレートとしてブラックプレートを使用することが不可欠です。

ペプチドごとに、サンプルあたり100マイクロリットルの総量で、アッセイごとに3つの技術的複製を調製します。適切な量のアッセイバッファーをアッセイプレートの各ウェルにピペットで入れます。各ウェルに0.5マイクロリットルのプロテアーゼを加えます。6つのウェルに、それぞれのプロテアーゼの代わりに0.5マイクロリットルのバッファーを追加します。これらのうち 3 つはブランク コントロールで、残りの 3 つはペプチド コントロールです。

ブ

ランクコントロールを除く各ウェルに5マイクロリットルのペプチドを最終濃度50マイクロモルまで加えます。3つのブランクコントロールウェルのそれぞれに、ペプチドの代わりに5マイクロリットルのバッファーを追加します。プレートを蛍光プレートリーダーに挿入し、[開始]をクリックします。