寄生虫感染赤血球の抗体媒介性食作用の定量化のためのアッセイ

熱

帯熱マラリア原虫に感染した赤血球を取ります。寄生虫のDNAを蛍光色素で標識し、寄生虫を可視化します。

これらの寄生虫に感染した赤血球を、マラリアに曝露された個人の血清とインキュベートします。これらの細胞は、血清中の自然に獲得されたヒトIgG抗体に付着した寄生虫抗原を表面に表示し、食作用のために細胞をオプソニン化します。

オプソニー化された寄生虫に感染した赤血球を、ヒト由来の単球(または食作用細胞)の懸濁液を含むタンパク質でコーティングされたマルチウェルプレートに移します。

インキュベーション中、単球上のFc-γ受容体はIgGオプソニン化赤血球と相互作用し、赤血球のファゴソームへの飲み込みを引き起こします。

インキュベーション後、プレートを遠心分離して、さらなる細胞相互作用を防ぎ、食作用を停止します。

上清を捨てます。塩化アンモニウム溶解液で処理し、単球に影響を与えることなく、非貪食感染赤血球を選択的に破裂させます。

溶解プロセスを停止するために血清含有バッファーを追加します。溶解した赤血球を含む上清を遠心分離して廃棄します。

単球を緩衝液に再懸濁します。

フローサイトメトリーを実施して、その中の寄生虫に感染した赤血球からの蛍光を示す単球を定量し、抗体を介した食作用を確認します。

精製された感染赤血球懸濁液を臭化エチジウムを含む寄生虫培養培地で10倍10〜7番目の細胞に3.3倍ずつ調整し、最終濃度2.5マイクログラム/ミリリットルに調整します。次に、プレートを廃棄物容器にフリックして、1つの96ウェルプレートからブロッキング溶液を取り除きます。次に、ペーパータオルで余分なものを取り除き、30マイクロリットルの臭化エチジウム標識感染赤血球懸濁液をプレートの上半分のウェルの1つを除くすべてのウェルに加えます。30マイクロリットルの寄生虫培養培地を空のウェルに加え、光から保護して室温でプレートを10分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、170マイクロリットルの寄生虫培地を各ウェルに加え、遠心分離によって感染した赤血球をプレートの底に沈殿させます。プレートを廃棄物容器にフリックして上清を取り除き、先ほど示したように、臭化エチジウム標識された感染赤血球をウェルあたり200マイクロリットルの寄生虫培養培地でさらに2回洗浄します。

2回目の洗浄後、マルチチャンネルピペットを使用して、ペレットを乱すことなく、各ウェルから上清の全量を慎重に除去し、臭化エチジウム標識された感染赤血球を、寄生虫培養培地で事前に調製した適切なコントロールおよびテストサンプルを含む30マイクロリットルの抗体溶液に再懸濁します。次に、プレートを摂氏37度で45分間置き、光から保護します。

感染した赤血球がオプソニン化されている間に、遠心分離によってTHP-1細胞を収集し、ペレットを12ミリリットルの新鮮な予熱されたTHP-1細胞培養培地に再懸濁します。

2回目の遠心分離後、ペレットを1ミリリットルのTHP-1細胞培養培地に再懸濁して計数し、細胞濃度をTHP-1細胞培養培地の1ミリリットルあたり5〜5番目の細胞に5倍に調整します。2番目の96ウェルプレートからブロッキング溶液を取り出し、各ウェルに100マイクロリットルのTHP-1細胞を加えます。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。

オプソニン化インキュベーションの最後に、オプソニン化プレートの各ウェルに170マイクロリットルの寄生虫培養培地を加え、遠心分離によって感染した赤血球をプレートの底に沈殿させます。オプソニン化した感染した赤血球を、マルチチャンネルピペットを使用してウェルあたり200マイクロリットルの寄生虫培養培地で2回洗浄し、2回目の洗浄後に上清を注意深く除去します。

オプソニン化した感染した赤血球をウェルあたり100マイクロリットルの予熱されたTHP-1細胞培養培地に再懸濁し、オプソニン化された感染した赤血球懸濁液50マイクロリットルを食作用プレート内の対応するウェルに移します。すべての細胞が添加されたら、プレートを光から保護して細胞培養インキュベーターに40分以内置きます。

インキュベーションの最後に、摂氏4度での遠心分離によって食作用を停止します。上清を除去し、ウェルあたり150マイクロリットルの室温塩化アンモニウム溶解液でペレットを再懸濁します。ちょうど3分後、100マイクロリットルの氷冷2%FBSをPBSに加えて溶解を停止し、遠心分離によって無傷の細胞を沈殿させます。

次に、200マイクロリットルの新鮮な氷冷2%FBSをPBSで、ウェルごとに、洗浄ごとに細胞を3回洗浄します。最終洗浄後、細胞ペレットをウェルあたりPBS中の200マイクロリットルの新鮮な氷冷2%FBSに再懸濁します。

フローサイトメトリーの取得と分析では、細胞をフローサイトメーターに直ちにロードし、感染した赤血球のないウェルに線形前方対線形側方散乱プロットを使用してTHP-1細胞をゲートします。このゲートで10,000のイベントを取得し、感染した赤血球をポジティブコントロールでオプソニン化したTHP-1細胞を使用して、臭化エチジウム蛍光強度を測定するためのヒストグラムプロットを設定します。

分析のために、感染した赤血球のないウェルの線形前方対線形側方散乱プロットを開き、THP-1細胞をゲートします。次に、FL3ヒストグラムにポジティブゲートを設定し、これらのゲートを他のすべてのサンプルウェルにコピーして、臭化エチジウム陽性THP-1細胞の割合を決定します。