蛍光レポーターを用いた好中球セリンプロテアーゼ活性測定のためのin vitroアッセイ

好中球セリンプロテアーゼまたはNSPを含むマイクロプレートを取ります。好中球から分泌されるタンパク質分解活性を持つこれらの可溶性酵素は、炎症反応で機能します。

NSPの切断部位として機能する認識モチーフを担う蛍光レポータープローブを追加します。プローブはドナーとアクセプター蛍光色素に結合します。

特定の波長による励起により、ドナー蛍光色素はエネルギーを放出します。ドナーに近いため、アクセプター蛍光色素はエネルギーを吸収し、異なる波長の蛍光を発します。

ドナーとアクセプターのシグナルを別々に検出し、ドナーとアクセプターの比率を計算してNSP活性を評価します。比率が低い場合は、プローブ切断がない場合のドナー蛍光の消光を示します。

NSPはプローブ上の認識モチーフを認識して切断し、アクセプターを解放します。

アクセプターからの距離により、ドナー蛍光色素からの蛍光発出が可能になり、ドナーとアクセプターの比率が向上します。比率が高い場合は、NSPによる効率的なプローブ切断を示します。

氷上で酵素を解凍し、テキスト原稿に記載されているように酵素標準曲線を設定します。標準調製と並行して、喀痰サンプルを活性化バッファーで希釈します。プレートリーダーで、NE FRETプローブNEmo-1の励起波長を354ナノメートルに、発光波長をドナーで400ナノメートル、アクセプターで490ナノメートルに設定します。

CG FRETプローブsSAMの場合、励起波長を405ナノメートルに設定し、ドナーの場合は発光波長を485ナノメートル、アクセプターの場合は580ナノメートルに設定します。40マイクロリットルのサンプル、標準、またはブランクをブラック96ウェルハーフエリアプレートのウェルに加え、マスターミックスを加えます。

プレートリーダーを起動し、少なくとも20分間、またはシグナルの増加がプラトーに達するまで、60〜90秒ごとにドナーとアクセプターの比率の増加を記録します。データをエクスポートし、各時点とサンプルのドナーRFUをアクセプターRFUで割ることにより、ドナーとアクセプターの比率を計算します。次に、ドナーとアクセプターの比率の平均と標準偏差を計算します。ドナーとアクセプターの比率の変化の線形成長内の傾きを決定します。