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全血サンプルに、好中球を除く血球に対する特異的抗体複合体を添加します。
抗体複合体結合血球に結合する磁性粒子を追加します。
免疫磁気タグ付きサンプルをマイクロ流体チップのセルローディングポートに移します。
磁気ディスクをセル・ローディング・ポートに接続します。
磁場は免疫磁気タグ付き細胞を引き付け、ポートの側壁に捕捉します。
タグが付けられていない好中球はチップに流れ込み、細胞ドッキング領域に閉じ込められます。
蛍光標識化学誘引剤溶液と移動培地を指定されたリザーバーに加えます。液体はマイクロ流体チャネルを通って流れ、濃度勾配を形成します。
化学誘引物質が好中球受容体に結合すると、細胞内の変化が引き起こされ、好中球が細胞骨格を再編成し、仮足を拡張させます。
これらの偽脚類は足として機能し、好中球をより高い化学誘引物質濃度に向かって推進します - 走化性と呼ばれるプロセス。
適切な顕微鏡技術を使用して、化学誘引勾配に応答した好中球の移動を監視します。
デバイスから脱イオン水を取り出し、出口から100マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を加えます。3分間待って、すべてのチャネルがフィブロネクチン溶液で満たされていることを確認します。次に、蓋をしたシャーレで室温で1時間インキュベートします。
次に、フィブロネクチン溶液をデバイスから取り出し、出口から100マイクロリットルの移行培地を追加します。ここでも、すべてのチャネルがマイグレーション・メディアで満たされるよう 3 分間待ちます。走化性実験でデバイスを使用する前に、室温でさらに1時間インキュベートします。10マイクロリットルの全血を1.5ミリリットルのチューブに入れます。次に、好中球単離キットからの2マイクロリットルの磁性粒子に2マイクロリットルの抗体カクテルを加え、抗体タグ付き細胞を磁気的に標識するためにチューブを穏やかに混合します。ラベル混合物を室温で5分間インキュベートします。
次に、デバイスのセルローディングポートの両側に2つの小さな磁気ディスクを取り付けます。デバイスのすべてのポートから培地を吸引します。次に、2マイクロリットルの標識された血液混合物をセルローディングポートからマイクロ流体装置にゆっくりとピペットで入れます。マイクロ流体デバイスを摂氏37度の温度制御された顕微鏡ステージに置きます。十分な好中球が細胞ドッキング領域に閉じ込められるまで数分待ちます。
次に、2つのピペッターを使用して、100マイクロリットルの移動培地中の100マイクロリットルの化学誘引剤溶液を指定された入口リザーバーに加えます。これにより、連続層流ベースの化学混合により化学誘引勾配が生成されます。化学誘引物質は、FMLPなどの組換えタンパク質、またはCOPD患者の喀痰の上清などの臨床サンプルである可能性があります。
流れが安定したら、チャネル内のFITCデキストラン勾配の蛍光画像を取得します。次に、温度制御された顕微鏡ステージ上、または従来の細胞培養インキュベーターでデバイスを15分間インキュベートします。インキュベーション後、10倍の対物レンズを使用してグラジエントチャネルを画像化し、データ分析のために細胞の最終位置を記録します。