がん細胞に対する事前活性化CD8⁺ T細胞の細胞毒性を研究するためのIn vitroアッセイ

2つのCD8 ⁺ T細胞集団を取ります:抗体を介したT細胞および共刺激受容体の結合によって事前に活性化されたエフェクターCD8 ⁺ T細胞と、骨髄由来サプレッサー細胞によって阻害された抑制されたCD8 ⁺ T細胞

。

これらのT細胞を、核制限蛍光タンパク質を発現するがん細胞を含む基底膜でコーティングされたウェルに追加します。

蛍光生成カスパーゼ-3基質(カスパーゼ-3認識部位含有ペプチドに結合したDNA結合蛍光色素)をピペットで

操作します。

インキュベート。エフェクターT細胞受容体は、がん細胞上のクラスIMHCペプチド複合体に結合し、パーフォリンとグランザイムを含む細胞傷害性顆粒の放出を引き起こします。

パーフォリンはがん細胞膜の細孔を作り、グランザイムの侵入とカスパーゼの活性化を可能にし、アポトーシスを開始します。

活性化されたカスパーゼはさらに蛍光性カスパーゼ基質を切断し、DNAに結合して蛍光を発する色素を放出します。

蛍光顕微鏡下では、エフェクターT細胞と共培養されたがん細胞は二重核蛍光を示し、がん細胞のアポトーシスを示します。

対照的に、抑制されたT細胞と共培養されたがん細胞は核タンパク質の蛍光のみを示し、非アポトーシス細胞を示唆しています。

事前に活性化されたCD8陽性T細胞標的細胞共培養を設定するには、まず、顕微鏡検査に適した96ウェル平底プレートの適切なウェルに30マイクロリットルの1〜100希釈成長因子還元可溶性基底膜マトリックスを追加します。プレートを振ってマトリックスを均一に広げ、プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも1時間置きます。プレートが平衡化している間に、ターゲットセルを準備します。培地を吸引し、PBSで洗浄し、1ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAを室温で1分間加えます。

ウ

シ胎児血清を添加した9ミリリットルのDMEMを穏やかなピペッティングで添加し、解離した細胞をチューブに移します。細胞を遠心分離した後、ペレットを500マイクロリットルのEDMEMに再懸濁します。再懸濁した細胞を細胞ストレーナーでろ過し、生細胞をカウントします。次に、密度を10倍10倍に調整し、氷上の新鮮なEDMEMで4番目の標的細胞を1ミリリットルあたり4回

目に調整します。

次に、事前に活性化されたCD8陽性T細胞を数回ピペットで移して、細胞を単一細胞懸濁液に再懸濁し、浮遊T細胞を条件ごとに1つの1.5ミリリットルチューブに移します。ウェルあたり200マイクロリットルのPBSで残りの細胞を回収し、洗浄液を適切な1.5ミリリットルチューブに移し、遠心分離します。培地を吸引し、遠心分離のために各チューブに1ミリリットルのEDMEMを加えます。

遠心分離後、チューブあたり100マイクロリットルの新鮮なEDMEMにペレットを再懸濁します。カウント後、各