マクロファージにおける複数のカスパーゼの活性化の評価

接

着した骨髄由来マクロファージを含むマルチウェルプレートから始めます。

マクロファージと融合し、ウイルスRNAを含むリボ核タンパク質を放出するインフルエンザAウイルスを導入します。

マクロファージのZ-DNA結合タンパク質1、またはZBP1は、ウイルスのリボ核タンパク質と相互作用し、キナーゼおよびカスパーゼ8とともにZBP1オリゴマー化を引き起こします。

オリゴマー化されたZBP1は、インフラマソームセンサータンパク質、アダプタータンパク質、およびプロカスパーゼ-1をさらに動員し、多量体複合体であるPANoptosomeを形成します。

PANoptosome 内では、イニシエーター カスパーゼ-8 が近接切断によって活性化され、カスパーゼ-3 および 7 を含むエフェクター カスパーゼがさらに活性化されます。

さらに、PANoptosome 内のインフラマソーム センサータンパク質はシグナル伝達カスケードを活性化し、プロカスパーゼ-1 をその活性型であるカスパーゼ-1 に変換します。

同時に、ウイルス感染はミトコンドリアからのシトクロム-cの放出を誘導し、アポトソームの活性化を引き起こし、プロカスパーゼ-9をその活性型に変換します。

ウイルス感染はまた、非標準的なインフラマソーム経路を引き起こし、カスパーゼ-11を活性化します。

溶解バッファーを導入してマクロファージを溶解します。溶解物を回収し、加熱してプロテアーゼを不活性化し、カスパーゼの分解を防ぎます。

遠心分離して、さらなる分析のために複数のカスパーゼを含む上清を収集します。

骨髄を単離し、BMDMを分化させた後、細胞をインフルエンザAウイルスに感染させます。20プラーク形成単位の感染の多重度で必要なウイルス量を計算します。BMDMから培地を取り出し、500マイクロリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。熱不活化FBSを含まない高グルコースDMEM中の450マイクロリットルのインフルエンザAウイルスを各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で加湿インキュベーターで1時間インキュベートして吸収させます。

1時間のインキュベーションの最後に、50マイクロリットルの熱不活化FBSを加え、プレートを摂氏37度のインキュベーターに合計12時間戻します。12時間のインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出します。150マイクロリットルの上清を吸引し、上清分析のためにこれを廃棄または保存します。残りの上清は取り除かないでください。

次に、ウェルあたり50マイクロリットルのカスパーゼ溶解バッファーと100マイクロリットルの4X SDSバッファーを組み合わせて、タンパク質収集溶液を作成します。次に、各ウェルに150マイクロリットルの混合物を加えます。

ウェルごとに、混合物をピペットで移動して、溶解した細胞と