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ヒト涙液サンプルと抗体ビーズカクテルを洗浄したアッセイプレートに加えます。
抗体は色分けされた磁気ビーズに結合し、異なるスペクトルシグネチャに対応するさまざまな割合の蛍光色素を含浸させ、複数のサイトカイン検出を容易
にします。
涙液サイトカインは、対応するビーズ結合捕捉抗体に結合します。
磁気プレートウォッシャーを使用して、抗体ビーズ複合体を沈降させます。バッファーを使用して、結合していない生体分子を除去します。
結合したサイトカインに結合するビオチン化検出抗体を添加します。
ピペットストレプトアビジン-フィコエリトリン複合体は、ビオチン化抗体に結合します。
プレートウォッシャーを使用して、結合されていないウェルの内容物を取り除きます。サイトカイン結合複合体をシース液に再懸濁します。
サンプル分析中、流体システムはビーズ複合体を光学アセンブリに輸送します。
最初のレーザーは内部ビーズ色素を活性化し、結果として得られる信号は特定のサイトカインを識別します。
2番目のレーザーは、ビーズ複合体に結合したレポーター分子を活性化し、そのシグナル強度はサイトカイン濃度を表し、複数のサイトカインの同時定量を可能にします。
ビーズベースのマルチプレックスアッセイを実行するには、すべての試薬を室温に戻し、5〜10秒間ボルテックスします。溶出した涙液サンプルをアッセイ前にマイナス80°Cで保存した場合は、凍結した涙液抽出物を氷上で解凍し、サンプルを1,000倍gで5分間遠心分離します。ヒトサイトカイン標準QC-1、QC-2、およびサンプルを作業するための縦型構成のアッセイワークシートを準備します。
プレートの各ウェルに200マイクロリットルの1x洗浄バッファーを加え、プレートシーラーで密封します。次に、プレートを室温のプレートシェーカーで10分間インキュベートします。次に、プレートを反転させて1x洗浄バッファーをデカントし、吸収性タオルに数回軽くたたいて、ウェル内の残留量の洗浄バッファーを取り除きます。
次に、25マイクロリットルの各作業ヒトサイトカイン標準QC-1、QC-2、およびアッセイバッファーとサンプルのみを含むブランクを適切なウェルに加えます。各ウェルに25マイクロリットルのアッセイバッファーを加えます。次に、ウェルに25マイクロリットルの1x抗体ビーズカクテル溶液を加えます。
抗体ビーズ溶液は光に敏感であるため、プレートを密封し、アルミホイルとプレートカバーで覆い、アッセイ中の光から保護します。プレートを摂氏4度でシェーカーで一晩インキュベートします。翌日、プレートを自動磁気プレートウォッシャーのプレートラックに置き、1分間放置してウェルの底に磁気ビーズを沈殿させます。
ウェル内容物を吸引し、自動磁気プレートウォッシャーを使用してウェルあたり200マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。プレートを1分間放置してから、先ほどのように井戸の内容物を吸引し、もう一度洗浄を繰り返します。各ウェルに25マイクロリットルの検出抗体溶液を加えます。プレートを密封し、アルミホイルとプレートカバーで覆い、シェーカーで室温で60分間インキュベートします。次に、25マイクロリットルのストレプトアビジン-フィコエリトリン溶液を各ウェルに加え、プレートを密封して覆った後、シェーカーで室温で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、プレートを磁気プレートワッシャーに置き、1分間放置します。次に、ウェル内容物を吸引し、ウェルあたり200マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。1分間放置してから、ウェルの内容物を吸引してから、もう一度洗浄を繰り返します。各ウェルに150マイクロリットルのシース液を追加します。次に、プレートを室温で5分間シェーカーに置き、抗体ビーズを再懸濁してから、プレートを読み取り、サイトカイン濃度を分析します。