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微量中和アッセイの場合は、インフルエンザ特異的中和抗体の濃度を下げた熱不活化、連続希釈されたヒト血清を含むマルチウェルプレートを取ります。
病原性インフルエンザウイルスを導入します。血清抗体はウイルスと相互作用し、ウイルスを中和します。ただし、血清希釈率が高いほど、ウイルスの中和作用は限られています。
Madine-Darby イヌ腎臓細胞、または MDCK 細胞で種子を出し、その表面にヒトシアル酸残基を過剰発現させます。
より高い希釈では、中和されていないインフルエンザウイルスが細胞のシアル酸と融合し、ウイルスゲノムを細胞質に放出します。
ウイルス遺伝子は転写され、宿主細胞内のウイルスタンパク質と核タンパク質に翻訳されます。
固定と透過処理のために高濃度のアセトンで処理します。
ウイルスの核タンパク質と相互作用する一次抗体を導入します。
一次抗体と相互作用する酵素結合二次抗体と重ね合わせます。酵素の基質で洗浄して処理し、着色製品を生成します。
色の強度を定量化し、血清希釈液に対してプロットします。50%のウイルス中和を達成する最高の血清希釈率は、中和力価を表します。
MNアッセイの1日目に、摂氏37度の水浴で血清を解凍し、解凍後すぐに除去します。テキストプロトコルに記載されているように、摂氏56度の水浴中でヒト血清を30分間熱不活化します。次に、血清を氷の上に置き、ウイルス希釈剤を血清に加えて、1〜10の事前希釈を実現します。
1つのウイルスでテストするには、11列目と12列目を除く行BからHに50マイクロリットルのウイルス希釈剤を追加します。次に、100マイクロリットルの希釈血清のうちの100を列A1〜A10に加えます。行 A から H まで 2 倍に連続希釈し、行 H で最後の 50 マイクロリットルを廃棄します。
ウイルス制御のために、50マイクロリットルのウイルス希釈液をウェルA12、B12、C12、およびD12に加えます。細胞コントロールの場合、ウェルE12、F12、G12、およびH12に100マイクロリットルのウイルス希釈液を追加します。対照血清については、100マイクロリットルの希釈対照血清をウェルAの列11に加え、50マイクロリットルのウイルス希釈液をウェルB11からH11に加えます。順次希釈します。プレートを覆い、ウイルス添加の準備が整うまで、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。
ウイルス添加の場合は、ウイルス希釈剤でウイルスを50マイクロリットルで100 TCID50に希釈します。50マイクロリットルの希釈ウイルスを、バック滴定プレートのカラム11と、すべてのプレートのセルコントロールウェルE12、F12、G12、およびH12を除くすべてのウェルに加えます。50マイクロリットルのウイルス希釈液を列11のすべてのウェルに加えます。次に、50マイクロリットルに100 TCID50で50マイクロリットルのウイルスを最初のウェルに加えます。
次に、50マイクロリットルを混合して連続するウェルに移し、2倍の連続希釈を実行します。ウイルスのキャリーオーバーを防ぐために、ウェル間でピペットチップを交換します。ウェルH11から50マイクロリットルを廃棄し、50マイクロリットルのウイルス希釈液をカラム11に加えて、最終容量を100マイクロリットルにします。プレートをタップして混ぜます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートしてから、1日目にMDCK細胞添加を行い、2日目にELISAを行います。
テキストプロトコルに記載されているように、一次抗体と二次抗体を添加した後、基質添加とプレート読み取りを行います。プレートを300マイクロリットルの洗浄バッファーで5回洗浄し、糸くずの出ないワイプを軽くたたきます。各ウェルに100マイクロリットルの新しく調製したOPD基質を加えます。次に、ウイルスコントロールウェルが0.8〜3の490ナノメートルの光学密度に達するまで、プレートを室温でインキュベートし、セルコントロールは0.2未満の低バックグラウンドODでインキュベートします。次に、100マイクロリットルの停止液をすべてのウェルに加えます。
マイクロプレート分光光度計を使用して、490ナノメートルのウェルの外径を読み取ります。最後に、テキストプロトコルに記載されているように、各血清サンプルの中和抗体価を決定します。