シロイヌナズナの葉板における免疫誘発時の酸化的バーストを検出するためのアッセイ

シ

ロイヌナズナの葉ディスクを入手します。乾燥を防ぐために、二重蒸留水を含むマイクロプレートウェルに浸漬します。

椎間板をインキュベートして、傷からの回復を可能にします。

インキュベーション後、水を取り除きます。細菌由来のペプチド、西洋わさびペルオキシダーゼ酵素、およびルミノールを含む反応混合物を加えます。

マイクロプレートリーダーを使用して、経時的な発光を測定します。

植物細胞上のパターン認識受容体(PRR)は、微生物に関連する分子パターンである細菌ペプチドに結合します。

さらに、PRRはその補受容体と結合し、相互リン酸化を受け、受容体様プロテインキナーゼを活性化し、細胞内カルシウム流入を引き起こします。

これにより、膜貫通呼吸バーストオキシダーゼホモログ、またはRBOHタンパク質が活性化されます。

活性化されたRBOHは、細胞外活性酸素種(ROS)の生成を触媒し、酸化バーストを引き起こします。さらに、ROSは過酸化水素に変換されます。

西洋わさびペルオキシダーゼは、過酸化水素を利用してルミノールを酸化して励起状態にし、基底状態に戻ると発光を発します。

発光を測定して、微生物のパターン認識後の急速な酸化バーストを監視します。

発芽後4〜5週間で、鋭利な4ミリメートルの生検パンチを使用して、シロイヌナズナ植物ごとに1つの葉の円盤を取り除き、静脈の中央を避け、傷を制限するように注意します。乾燥を防ぐために、ウェルあたり100マイクロリットルの二重蒸留水を軸側を上にした未使用の96ウェルルミノメータープレートの個々のウェルにディスクを収集します。

複数の誘離因子を評価する場合は、誘導体処理ごとに同じ葉から2番目のリーフディスクを取り出し、プレートを蓋で覆い、リーフディスクが室温で一晩回復できるようにします。翌朝、マイクロプレートリーダーのパラメータを40〜60分間隔で1,000ミリ秒の積分時間に設定し、動的な酸化バーストをキャプチャします。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの水を100マイクロリットルの新しく調製された反応溶液に置き換え、各遺伝子型の対照なし誘発反応を含めて、誘発がない場合の基礎反応酸素種レベルを評価します。次に、すぐに、マイクロプレートリーダーで可視スペクトルのすべての波長の発光を測定します。