単球単分子膜におけるFcγ受容体駆動型食作用の研究のためのアッセイ

赤血球(RBC)から始めます。

赤血球表面抗原に特異的なポリクローナル抗体を添加します。

インキュベート。抗体は、表面抗原への特異的結合によって赤血球をコーティングすることにより、赤血球をオプソニン化します。

遠

心分離して、結合していない抗体を除去します。

再

懸濁した抗体オプソニン化赤血球を、単球単層を含むマルチチャンバースライドに加えます。インキュベート。

単球上の表面Fcガンマ受容体は赤血球に結合したポリクローナル抗体のFc領域に結合する

この結合により、接触領域の周囲にFc受容体が集まり、細胞内シグナル伝達が引き起こされ、単球のアクチン細胞骨格の再編成が起こります。

この細胞骨格の再構成は、偽足の伸長を誘導し、オプソニン化された赤血球の周囲に食細胞カップを作成します。

食細胞カップはオプソニン化された赤血球を徐々に包み込み、膜結合した食体内に完全に飲み込まれます。

インキュベーション後、スライドをバッファーで洗浄して、食作用のない赤血球を除去します。細胞を固定します。

取り付け材を使用してスライドを取り付けます。

位相差顕微鏡法を実行して、単球内の貪食された赤血球を視覚化および定量します。

R₂R₂赤血球をオプソニン化するには、まず赤血球をPBSで3回洗浄します。3回目の遠心分離後に、ヒト血清からのポリクローナル抗D抗体で1対1の比率でR₂R₂ペレットを希釈し、断続的に混合しながら摂氏3度で1時間インキュベートします。オプソニン化の最後に、細胞をインキュベーターから取り出し、先ほど示したようにPBSでさらに3回洗浄します。

ペレットを完全なRPMI培地で1.25%の体積対体積に再懸濁します。次に、8チャンバースライドの各ウェルの上清を400マイクロリットルのオプソニン化R₂R₂細胞で摂氏37度で2時間交換します。インキュベーションの最後に、スライドアダプターを使用してチャンバーを取り外し、余分なR₂R₂をペーパータオルで軽くたたきます。

次に、100ミリリットルのビーカーにPBSを入れ、各スライドを塩溶液に30〜40回ゆっくりと浸して、貪食されていないR₂R₂の大部分を除去します。乾燥後、スライドを100%メタノールで45秒間固定し、細胞を乾燥させてからサンプルをカバーガラスで取り付けます。

翌日、各スライドを40倍対物レンズを備えた位相差顕微鏡にロードし、両手に1つのカウンターを使用して、少なくとも200個の単球と各単球内の食作用R₂R₂の数を手動でカウントし、サンプルあたりの単球数と食作用作用R₂R₂細胞の数を同時に定量化します。