JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 5:13 分 • July 8th, 2025
マウス樹状細胞、または同種抗原または自己抗原の遺伝的変異体を運ぶDCを含むマルチウェルプレートから始めます。
外来抗原を認識しながら、自己抗原に反応しない同種反応性T細胞を含むマウスT細胞を導入します。
同種反応性T細胞はこれらの同種抗原を認識し、DCと相互作用し、F-アクチン再編成を含む細胞骨格再構成を引き起こします。
これにより、T 細胞上の受容体が DC 上の共刺激分子と結合するように促進され、細胞接続、つまり免疫シナプスが形成されます。
細胞を固定し、チューブに移し、T細胞およびDC受容体に特異的な蛍光色素標識抗体のカクテルを導入し、明確な蛍光を与えます。
結合していない抗体を除去し、細胞を透過性化する透過処理剤と、F-アクチンに結合する緑色の蛍光色素タグ付きタンパク質マーカーを含むバッファーに細胞を再懸濁します。
細胞を遠心分離し、核色素を含む緩衝液に再懸濁し、核を赤く染色します。
イメージングフローサイトメトリーを使用して、F-アクチンの緑色の十字線を持つT細胞およびDC複合体に対応するダブレットを特定し、シナプス形成を確認します。
同種反応性の程度を表すダブレットを定量化します。
まず、10倍から6番目の樹状細胞を96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種し、続いて10倍から6番目のT細胞を1倍10回播種し、ウェルあたり合計最大50マイクロリットルの培地の最終容量に播種します。低温培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で4時間インキュベートします。
次に、PBS中の1.5%ホルムアルデヒドの培養量の3倍を各ウェルに室温で30分間添加します。固定の最後に、各ウェルから細胞を対応する5ミリリットルのポリスチレンチューブに移し、光から保護した室温で30分間、100マイクロリットルの洗浄バッファーで適切な蛍光色素結合抗体で細胞を染色します。
次に、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ファロイジン-FITCを含むパーマ洗浄バッファーにペレットを再懸濁します。光から保護された室温でさらに30分間後、1ミリリットルの新鮮なパーマ洗浄バッファーで細胞を洗浄します。ペレットをパーマ洗浄バッファー中の目的の核色素に再懸濁し、光から保護された室温で最後の30分間インキュベーションし、細胞を1ミリリットルのパーマ洗浄バッファーで洗浄し、続いて洗浄バッファーのみで1回洗浄します。次に、細胞を50〜100マイクロリットルの新鮮な洗浄バッファーに再懸濁し、細胞を小さなキャップ付きの微量遠心チューブに移します。
細胞間相互作用を解析するには、まず明視野画像取得用に1つのチャネルを確保し、最初のコントロールチューブをロードします。明視野チャンネルをオフにした状態で、ワークスペースウィンドウで、エリア全体のアスペクト比で使用するチャネルごとに新しい散布図を作成し、アスペクト比が1に近いシングルレットをゲートします。
蛍光色素ごとに、ポジティブ母集団を確認し、必要に応じて照明ボックス内のレーザー電圧を調整します。[チャネル]ボックスで、染色に使用する蛍光色素の適切なチャネルを選択します。次に、[記録] をクリックします。イベント数が指定されたしきい値に達すると、取得は自動的に停止します。
すべての単一染色コントロールが取得されたら、最初の実験サンプルチューブをロードし、明視野チャネルを含む適切な分析チャネルで数万のイベントを取得します。