フローサイトメトリーによる気管支肺胞洗浄液中の免疫細胞の同定と列挙

緑色の蛍光生存率色素で染色された免疫細胞集団を含むマウス気管支肺胞洗浄液を含むマルチウェルプレートから始めます。

Fc抗体を導入して、免疫細胞のFc受容体をブロックします。

特定の細胞マーカーを標的とする異なる蛍光色素標識抗体のカクテルを追加します。結合していない抗体を除去し、細胞をバッファーに再懸濁します。

フローサイトメトリーを使用して、生細胞を示す薄暗い蛍光一重項を同定します。

488ナノメートルで細胞を照射し、細胞にCD11c発現細胞と相関する赤色蛍光を発します。

高CD11c集団内で、適切な波長フィルターを使用して、樹状細胞の細胞マーカータンパク質MHC-IIとマクロファージのSiglecFを同定します。

CD11c低集団では、T細胞でのCD3およびB細胞でのCD19の発現により、それらの同定が可能になります。

405ナノメートルで細胞を照らし、CD11bを発現する好中球を示す青色蛍光を発します。

633ナノメートルで細胞を照射すると、Ly-6G発現好酸球上の遠赤外蛍光色素が興奮します。

フローサイトメトリーデータを使用して、気管支肺胞洗浄液中の各タイプの免疫細胞の存在量を列挙します。

3回目の気管支肺胞洗浄採取後、プールした吸引液を遠心分離し、上清を摂氏負80度で保存します。ペレットを200マイクロリットルのACK溶解バッファーに再懸濁します。室温で2分以内に、溶解バッファーを1ミリリットルの冷たいPBSで希釈し、遠心分離によって細胞を回収します。

分析するサンプルの数に応じて適切な量のPBSにペレットを再存在させ、分析のために細胞を96ウェルプレートの適切な数のウェルに分注します。別の遠心分離によって細胞を収集し、ペレットをPBS中の50マイクロリットルのFCブロックに再懸濁します。

室温で10分後、目的の適切な抗体カクテル50マイクロリットルを各ウェルに加え、光から保護された摂氏4度で細胞を30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、プレートを遠心分離し、上清を廃棄し、フローサイトメトリー分析のためにウェルあたり200マイクロリットルのFACSバッファーの最終容量にペレットを再懸濁します。