マイコバクテリアに対する試験化合物活性を評価するための木炭寒天レサズリンアッセイ

マイコバクテリアを含むマルチウェルプレートを取ります。試験化合物の濃度を上昇させてウェルに加えます。

インキュベート。マイコバクテリアに対する化合物の作用に応じて、マイコバクテリアの増殖を阻害して静菌活性を示すか、マイコバクテリアを排除して殺菌活性を示すことができます。

ウェルアリコートを木炭寒天レサズリンアッセイ(CARA)に移し、活性炭を含む寒天を含むマイクロプレートに移し、試験化合物を吸収し、キャリーオーバー効果を防ぎます。

インキュベート。この化合物の静菌活性はマイコバクテリアの複製を阻害しますが、殺菌活性はマイコバクテリアの生存率を低下させます。

緩衝液、レサズリン、および非イオン性界面活性剤を添加して、ウェル内にレサズリンを分散させます。

代謝活性な抗酸菌では、デヒドロゲナーゼは青色の弱蛍光レサズリンをピンク色の蛍光レゾルフィンに還元します。

マイクロプレートリーダーを使用して、ウェル内のレゾルフィン蛍光を測定します。

レゾルフィン蛍光を欠くウェルは、化合物の殺菌活性を示します。

ウェル全体で蛍光強度が変化すると、試験化合物の濃度依存性の殺菌力または静菌力を反映して、生きた細菌の負荷を示します。

それぞれ

4または20ミリリットルのMiddlebrook 7H9-ADN、または7H9-OADCを含むポリプロピレン丸底または円錐形遠心分離管に、0.01〜0.1のOD₅₈₀でM.smegmatisを接種します。M.smegmatis培養物を摂氏37度、20%O₂で振とうしながらインキュベートし、培養物を対数期または0.5のおおよそのOD₅₈₀まで拡大します。

複製および非複製条件下で最小阻害濃度スタイルの実験を設定するには、200マイクロリットルの細胞を7H9-ADNのOD₅₈₀で0.01で、透明な底の組織培養処理された96ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。

非複製アッセイでは、0.02%チロキサポールを含むPBSを使用して細胞を2回洗浄し、非複製培地を使用して細胞を再懸濁します。非複製培地を使用して細胞をOD₅₈₀ 0.1に希釈し、新たに調製した1モルストックから亜硝酸ナトリウムを最終濃度0.5〜5ミリモルまで添加します。

200マイクロリットルの細胞をOD₅₈₀ 0.1で、底が透明な組織培養処理済み96ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。テキストプロトコルに従って試験剤を調製した後、2マイクロリットルの試験剤#1をA列からEに加え、2マイクロリットルの試験剤#2を列EからHに加え、完全に混合します。

アッセイを複製するには、M.smegmatisマイクロプレートを摂氏37度、20%O₂、および5%CO₂で1〜48時間インキュベートします。CARAを読み出しとして使用する時点で、50〜75マイクロリットルに設定されたP200マルチチ