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マイコバクテリアを含むマルチウェルプレートを取ります。試験化合物の濃度を上昇させてウェルに加えます。
インキュベート。マイコバクテリアに対する化合物の作用に応じて、マイコバクテリアの増殖を阻害して静菌活性を示すか、マイコバクテリアを排除して殺菌活性を示すことができます。
ウェルアリコートを木炭寒天レサズリンアッセイ(CARA)に移し、活性炭を含む寒天を含むマイクロプレートに移し、試験化合物を吸収し、キャリーオーバー効果を防ぎます。
インキュベート。この化合物の静菌活性はマイコバクテリアの複製を阻害しますが、殺菌活性はマイコバクテリアの生存率を低下させます。
緩衝液、レサズリン、および非イオン性界面活性剤を添加して、ウェル内にレサズリンを分散させます。
代謝活性な抗酸菌では、デヒドロゲナーゼは青色の弱蛍光レサズリンをピンク色の蛍光レゾルフィンに還元します。
マイクロプレートリーダーを使用して、ウェル内のレゾルフィン蛍光を測定します。
レゾルフィン蛍光を欠くウェルは、化合物の殺菌活性を示します。
ウェル全体で蛍光強度が変化すると、試験化合物の濃度依存性の殺菌力または静菌力を反映して、生きた細菌の負荷を示します。
それぞれ4または20ミリリットルのMiddlebrook 7H9-ADN、または7H9-OADCを含むポリプロピレン丸底または円錐形遠心分離管に、0.01〜0.1のOD580でM.smegmatisを接種します。M.smegmatis培養物を摂氏37度、20%O2で振とうしながらインキュベートし、培養物を対数期または0.5のおおよそのOD580まで拡大します。
複製および非複製条件下で最小阻害濃度スタイルの実験を設定するには、200マイクロリットルの細胞を7H9-ADNのOD580で0.01で、透明な底の組織培養処理された96ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。
非複製アッセイでは、0.02%チロキサポールを含むPBSを使用して細胞を2回洗浄し、非複製培地を使用して細胞を再懸濁します。非複製培地を使用して細胞をOD580 0.1に希釈し、新たに調製した1モルストックから亜硝酸ナトリウムを最終濃度0.5〜5ミリモルまで添加します。
200マイクロリットルの細胞をOD580 0.1で、底が透明な組織培養処理済み96ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。テキストプロトコルに従って試験剤を調製した後、2マイクロリットルの試験剤#1をA列からEに加え、2マイクロリットルの試験剤#2を列EからHに加え、完全に混合します。
アッセイを複製するには、M.smegmatisマイクロプレートを摂氏37度、20%O2、および5%CO2で1〜48時間インキュベートします。CARAを読み出しとして使用する時点で、50〜75マイクロリットルに設定されたP200マルチチャンネルピペットを使用して、MIC90スタイルのアッセイプレートのウェル内容物を5〜10回上下にピペッティングして慎重に再懸濁します。次に、ピペットチップを使用して、ウェルの内容物を円を描くように穏やかに旋回させます。
10マイクロリットルの原液アッセイウェル内容物をCARAマイクロプレートの対応するウェルに移し、移送中の飛散を避け、10マイクロリットルのアリコートがCARAマイクロプレートウェルの中央にスポットされるようにします。プレートテープを使用して、CARAマイクロプレートのスタックを結合し、再密封可能なビニール袋に入れます。M.smegmatis CARAマイクロプレートを摂氏37度で20%O2で1〜2日間、複製プレートの場合は1〜2日間、非複製プレートの場合は2〜3日間インキュベートします。
細菌増殖のフィルム、またはより大きな肉眼的コロニーがネガティブコントロールウェルに見られる場合は、マルチチャンネルピペットを備えた12個のP200チップの1セットを使用して、ウェルの側面に沿って40マイクロリットルの滅菌PBSを分注し、PBSが寒天細菌マイクロコロニーの上部に分布するようにします。
5ミリグラムのレサズリンと50ミリリットルの5%トゥイーン-80をPBSに混合して、CARA現像試薬を調製します。新たに調製したCARA現像試薬50マイクロリットルをCARAマイクロプレートの各ウェルに加えます。次に、プレートを前後に数回揺らして、各ウェルの寒天と細菌マット全体に試薬を分散させます。プレートを再密封可能なビニール袋に入れ、M. smegmatisについては摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。
蛍光を読み取る前に、蓋を外した状態でCARAマイクロプレートを室温で15分間バイオセーフティフードに入れます。バイオセーフティキャビネットの外でBSL3分光光度計を使用する場合は、プレートの上に光学品質のPCRステッカーを貼り付け、柔らかいペーパータオルを使用してステッカーの表面を軽く押してしっかりと密封します。530ナノメートルでの励起と590ナノメートルでの発光でトップリードを介して蛍光を決定します。