マクロファージにおけるTLR依存性NF-кB/AP-1転写因子シグナル伝達のアッセイ

誘導

性プロモーターの下で、分泌された胚性アルカリホスファターゼまたはSEAP酵素の遺伝子を持つレポーターマクロファージを含むチューブを取ります。

1本のチューブに、マクロファージトール様受容体2またはTLR2に特異的な抗体を導入し、その活性を中和します。

別の例では、TLR4シグナル伝達を抑制する阻害剤を追加します。最後のチューブは未処理のままにしておきます。

損傷関連分子パターンまたはDAMP(細胞壊死中に放出されるタンパク質)の吸着層を備えたチャンバー状スライドを取ります。

処理済みマクロファージと未処理マクロファージを別々のウェルに加え、インキュベートします。

未処理のマクロファージ上のTLR2およびTLR4はDAMPに結合し、転写因子核因子-κ-B(NF-κB)および活性化タンパク質-1(AP-1)を活性化します。

これらは核に移動し、SEAPプロモーターに結合し、細胞外で分泌されるSEAP産生をアップレギュレートします。

SEAP含有上清を発色基質のマイクロプレートに移します。

SEAP は基材を加水分解し、紫青色の生成物を生成します。吸光度を測定します。

TLR2 中和は SEAP 産生を強く減少させ、TLR2 が一次メディエーターであることを示しています。

Toll様受容体を介したNF-kB / AP-1活性に対する吸着タンパク質層の影響を評価するために、適切なサイズのフラスコでレポーターマクロファージを70%コンフルエンスまで増殖させた後、実証されているように、適切な酵素解離溶液で細胞を分離します。

細胞を7.3 x 10 5細胞/ミリリットル濃度でアッセイ培地に再懸濁し、3本のチューブ間で細胞を均等に分注します。細胞の最初のチューブを1ミリリットルあたり1マイクログラムのTLR4阻害剤で室温で60分間処理します。2 番目のチューブを 50 マイクログラム/ミリリットルの抗 TLR2 抗体で室温で 30 分間処理し、3 番目のチューブを処理せずに室温のままにします。

細胞がインキュベートしている間に、200マイクロリットルのライセートと10%ウシ胎児血清を条件ごとに3つの粘着性ウェルに加えます。タンパク質を摂氏37度で適切な実験期間吸着させてから、ウェルごとに新しいパスツールピペットでタンパク質溶液を吸引し、ウェルあたり250マイクロリットルのPBSで粘着性のあるウェル表面を5分間洗浄3回

洗浄します。

レポーターマクロファージ処理の最後に、各ウェルに200マイクロリットルの細胞溶液を加えます。回路図に示すように、Pam3CSK4を150ナノグラム/ミリリットルの最終濃度でTLR2ポジティブコントロールとして2つのウェルに加えます。

TLR4陽性対照の場合、リポ多糖類を1ミリリットルあたり1.5マイクログラムの最終濃度まで2つのウェルに加えます