CAR-T細胞の効力を評価するためのリアルタイムIn vitro細胞溶解アッセイ

細胞培養培地を含むE-Plate(各ウェルの底に金の微小電極を備えたプレート)から始めます。

ターゲット

がん細胞をプレートに播種し、金の微小電極に付着し、電極間に物理的な障壁を形成します。

プレートをセルアナライザーに移し、電気信号を印加します。

接着したセルは電極間の電子の流れを妨害し、インピーダンスとして測定される電子の流れを妨

げます。

これらのセルが増殖して電極に付着すると、電気インピーダンスは付着セル数に比例して増加し、リアルタイム測定が可能になります。

キメラ抗原受容体T細胞またはキメラ抗原受容体を発現するCAR T細胞を導入します。これらの受容体はがん細胞の抗原と相互作用し、T 細胞を活性化し、免疫シナプスを形成します。

活性化されたCAR T細胞は、パーフォリンやグランザイムなどの細胞毒性物質を放出します。

パーフォリンはがん細胞膜に細孔を形成し、グランザイムが細胞に侵入して細胞溶解を誘導するのを促進します。

これにより、細胞の剥離が促進され、電気インピーダンスが低下し、CAR T 細胞の細胞溶解能と相関します。

リアルタイムの細胞溶解効力アッセイでは、Eプレートの各ウェルに50〜100マイクロリットルのターゲット細胞培養培地を加え、細胞分析装置でバックグラウンドインピーダンスを測定します。

トリプシンを使用して、標的がん細胞を培養プレートから切り離します。細胞を15ミリリットルの新鮮な培地で洗浄し、遠心分離します。がん細胞ペレットを5ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁して計数し、細胞密度を適切な標的細胞濃度に調整します。細胞を適切な数のウェルに加え、Eプレートを室温で30分間放置して、細胞がウェルの底に均一に沈殿するようにします。

平衡化期間の終わりに、プレートをリアルタイムセルアナライザーに入れ、一晩中15分ごとにインピーダンスの測定を自動的に開始します。標的細胞の接着と増殖をリアルタイムで追跡できます。

翌朝、エフェクターCARとコントロールT細胞を個々のチューブで適切な濃度に希釈し、Eプレートの各ウェルから50〜100マイクロリットルを除去して、各ウェルの最終容量が100マイクロリットルになるようにします。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの培地で適切なエフェクターとターゲットの比率で、適切なウェル内のエフェクターT細胞とコントロールT細胞を確認します。次に、プレートを細胞分析装置システムに戻す前に、室温で30分間プレートを平衡化します。

標的がん細胞のT細胞媒介性殺傷の有効性を測定するには、CAR-T細胞媒介性殺傷を96時間監視します。