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マウス線維芽細胞を含むマルチウェルプレートを血清欠乏培地に取ります。TNFα特異的抗体の連続希釈液を追加します。
炎症性サイトカインであるTNFαを追加します。
インキュベート。血清欠乏は細胞ストレスを誘発し、細胞をTNFαを介したアポトーシスにかかりやすくします。
血清欠乏細胞上の受容体に結合するTNFαは、細胞内シグナル伝達カスケードを引き起こし、カスパーゼカスケードを活性化し、アポトーシスを誘導します。
しかし、TNFαへの抗体結合は、その受容体結合を妨げ、カスパーゼの活性化を阻害します。
インキュベーション後、界面活性剤、プロルミネセンスカスパーゼ基質、ルシフェラーゼ酵素を含む試薬混合物をATPおよびマグネシウムイオンとともに加えます。混合してインキュベートします。
界面活性剤は膜を透過性化し、TNFα誘導細胞からカスパーゼを放出します。
生物発光基質には、カスパーゼ認識部位が含まれています。特定のカスパーゼが基質を切断し、アミノルシフェリンを生成します。
ルシフェラーゼは基質であるアミノルシフェリンを酸化し、発光します。
発光強度を測定して、抗体濃度の増加に伴う発光の低下を検出し、TNFαを中和し、TNFα誘導性アポトーシスを防ぐTNFα特異的抗体の効力を示します。
50マイクロリットルの細胞懸濁液を、2列目から11列目まで、アッセイプレートの内部60ウェルに加えます。ピペッティングによって細胞懸濁液を混合し、マイクロプレートにアリコートを追加します。すぐに、マッピングされた希釈液の50マイクロリットルをアッセイプレートに移します。
平行レーンの場合は、マイクロピペットを回転させて希釈液を分注します。マッピングされた希釈液は、次の順序でウェルに分注できます。コントロールは周囲の井戸に分配されます。
TNF-αを500マイクロリットルの超純水で希釈します。ボルテックスミキサーで2,200 RPMで混合します。15 mLチューブに移し、最後にアッセイ培地で1 mLあたり40ナノグラムに希釈します。50マイクロリットルのアポトーシス誘導溶液を60の内部外部ウェルに分注します。マイクロリットルのアポトーシス誘導溶液を60個の内部アッセイウェルに分注します。最後に、16時間インキュベートします。
5日目に、製造元の指示に従って緩衝液で基質を再構成します。5回反転させて混ぜます。基質溶液を分注し、アッセイプレート内の各サンプルウェルに50マイクロリットルの基質溶液を加えます。また、コントロールに基板を追加します。ボルテックスミキサーでアッセイを400 RPMで3分間撹拌します。
ミキサーからアッセイプレートを取り出し、室温でインキュベートします。プレートリーダー分光光度計の電源を入れます。Softmax Pro ソフトウェアまたは同等のプログラムを開きます。マイクロプレートを分光光度計にロードし、次のパラメータを調整します。
リグタイプのエンドポイント機能で発光機能をアクティブにします。列 1 と 12 を除くリグ領域を調整します。プレートタイプは、96ウェルの標準透明底マイクロプレートに選択してください。積分時間を最大 1250 ミリ秒まで変更します。マイクロプレートの振とう時間を10秒に調整します。参照物質、分析物質、および対照サンプルを配置する壁を選択します。読み始めます。