リンパ球増殖を誘導するためのワクチンパルス樹状細胞ベースのIn Vitroアッセイ

、試験ワクチン抗原を樹状細胞培養物に加えます。

樹状細胞は抗原を認識し、受容体を介したエンドサイトーシスを介して抗原を内在化し、より小さなペプチドに断片化し、得られた抗原-MHC複合体を細胞表面に転移して提示します。

抗原提示樹状細胞をナイーブTリンパ球と共培養して、T細胞受容体と抗原-MHC複合体、およびそれらの補受容体との間の相互作用を可能にします。

これは免疫学的シナプス形成につながり、細胞内シグナル伝達を介してTリンパ球を活性化します。

活性化されたTリンパ球はクローン増殖を起こし、エフェクターTリンパ球を生成します。

インターロイキン-2、またはIL-2サイトカイン分子を培養物に加え、インキュベートします。IL-2 の結合は細胞内シグナル伝達を引き起こし、リンパ球の増殖と生存を可能にします。

少量の培養物と遠心分離機を取ります。上清を捨てます。細胞ペレットを抗原提示樹状細胞で再懸濁し、同じウェルに移します。

抗原による再刺激はリンパ球の増殖を増加させます。

下流の分析を実行して、リンパ球増殖に関連する特定のマーカーを定量します。

抗原パルスMoDCを生成するには、24ウェルプレート内の1ミリリットルのナイーブMoDC培養物に1ミリリットルの狂犬病ウイルスワクチンまたはRV懸濁液1マイクロリットルを加え、プレートを5%二酸化炭素と摂氏37度で48時間インキュベートします。7日目に、抗原パルスMoDCを含む24ウェルプレートを氷上に10分間保持してから、ウェルあたり1ミリリットルの氷のように冷たいPBSを加え、完全に混合します。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。

2ミリリットルの氷冷PBSでウェルを洗浄します。各ウェル内の残留細胞を収集し、洗浄した内容物をそれぞれのチューブに移します。細胞懸濁液を500 gで7分間遠心分離します。上清を廃棄した後、抗原パルスMoDCs細胞ペレットを完全な培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり100,000細胞の最終濃度を調整します。

MoDCリンパ球共培養の場合、抗原パルスの7日目に、1ミリリットルのナイーブリンパ球細胞懸濁液と1ミリリットルの抗原パルスまたは非抗原パルスMoDC懸濁液を無菌24ウェルプレートのウェルに播種します。2日間のインキュベーション後、各ウェルに1ミリリットルあたり20ナノグラムの組換えインターロイキン-2を補充し、さらに120時間インキュベーションを続けます。

14日目に、1ミリリットルの共培養物を滅菌1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを遠心分離します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの抗原パルスまたは非パルスMoDCで再懸濁します。よく混合し、細胞懸濁液を対応するウェルに移します。

PBMCおよびナイーブリンパ球および単球の細胞表面染色後、1ミリリットルの細胞懸濁液をピペットを使用して滅菌1.5ミリリットルチューブに移し、500gで10分間遠心分離します。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。また、1ミリリットルのPBSを使用して残存細胞と対応するチューブを収集します。次に、細胞の入った15ミリリットルのチューブに10ミリリットルのPBSを加え、ピペッティングで混合します。

チューブを850gで7分間遠心分離した後、上清を取り除き、上清をデカントした後に残った残留懸濁液で細胞ペレットを慎重に再懸濁します。細胞懸濁液をV底96ウェルプレートに移し、こぼれないようにウェルを密閉します。

染色が完了したら、フローサイトメーターによる分析を行います。リアルタイムプレビューから、電圧、ゲイン、セルサイズなどの蛍光の閾値を調整して、最終的に細胞破片を排除しながら、目的の細胞集団の周囲にゲートを描画します。