造血ポケットへの血球再接着を評価するための血球障害アッセイ

ガラスビーズと、蛍光標識血球(循環血球と常在血球を含む昆虫の血球)を発現するショウジョウバエの幼虫が入ったチューブから始めます。

常駐する血球は造血ポケットに付着し、血球生成のニッチです。

機械的に、幼虫を乱して、常在血球を造血ポケットから循環器系に放出します。

回復中、常在血球の受容体は造血ポケットと相互作用し、再付着します。

回復後、1匹の幼虫を特殊なスライドガラスウェルに入れ、前端と後端の腹側に切開を行い、循環血球を放出します。

洗浄して残りの循環血球を除去します。同じ幼虫を新しい井戸に移し、こすって常駐血球を取り除きます。

蛍光顕微鏡下で、放出された循環血球と常在血球を列挙します。

障害後の回復時間が長くなると、回復開始と比較して循環血球の減少と常在血球の増加により、造血ポケットへの再付着が確認されます。

常駐血球を機械的に妨害するには、最大4〜8匹の幼虫を選択し、約0.5グラムの600ミクロンのガラスビーズと0.5ミリリットルの水を入れた2ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。チューブを手で速度10で1分間渦にします。

微量遠心チューブの中身をペトリ皿にこぼし、絵筆で幼虫を摘み取ることで、ガラスビーズから幼虫を取り出します。回復段階では、ハエの餌の薄い層で事前に準備したペトリ皿に幼虫を入れます。幼虫を45分間インキュベートして、幼虫が血球パターンを再確立できるようにします。回復期間の後、出血掻き取り解剖を続行します。