SIV特異的CD8+メモリーT細胞を解析するためのペプチド-MHC-I四量体染色技術

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ル免疫不全ウイルスまたはSIVに対するCD8+メモリーT細胞を含む非ヒト霊長類末梢血単核細胞(PBMC)を取ります。

プロテインキナーゼ阻害剤を追加して、その後の刺激時にT細胞受容体またはTCRの内在化を防ぎます。

SIV特異的ペプチドに結合した4つのMHC-I分子を含む蛍光色素結合複合体であるペプチド主要組織適合性複合体クラスI、またはpMHC-I四量体を導入します。これらのペプチドは、T細胞表面のTCRに結合します。

CD8、CD28、CCR7(メモリーT細胞サブセットを示すマーカー)に結合する蛍光色素結合抗体と、非CD8+細胞を標識する抗体を含む混合物を加えます。

蛍光生存率色素は死んだ細胞を標識します。

セルを修正します。それらを透過して細胞内標的にアクセスします。

T細胞マーカーであるCD3と活性化されたCD8+ T細胞マーカーである細胞内グランザイムBに結合する蛍光色素結合抗体を追加します。

フローサイトメトリーを使用して、非CD8 + T細胞と死細胞を除外します。

granzyme B、CD28、およびCCR7レベルに基づいて異なるメモリCD8+ T細胞サブセットを特徴付けるために、pMHC-I四量体陽性CD8 + T細胞をゲートします。

カゲザルPBMCをR-10培地に1.6倍10〜7番目の細胞/ミリリットル濃度で再懸濁することから始めます。50マイクロリットルの細胞を適切な数のフローサイトメトリーチューブに分注し、各チューブに50マイクロリットルのプロテインキナーゼ阻害剤を加えます。各チューブをボルテックスし、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。

滴定ペプチドMHC四量体の正しい量は、すべての実験管を染色するのに十分なマスターミックスを希釈する必要があります。したがって、ピペッティングエラーを考慮して、マスターミックスを15%過剰に調製することが重要です。

細胞がインキュベートしている間に、タンパク質凝集体と四量体溶液を遠心分離によってペレット化し、バックグラウンド染色を最小限に抑えます。次に、テトラマーを十分な染色バッファーで希釈し、25マイクロリットルのテトラマーマスターミックスを各フローサイトメトリーチューブに加えることができます。次に、サンプルチューブをボルテックスし、PBMC四量体溶液を室温で暗所で45分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、50マイクロリットルの染色マスターミックスを適切なサンプルチューブに加え、ボルテックスによってチューブを混合します。

室温で暗所で25分間放置した後、細胞を洗浄バッファーで洗浄し、遠心分離によって細胞をペレット化し、ペレットを乱さずに上清を慎重にデカントします。各チューブの残りのバッファー内の細胞をボルテックスし、チューブあたり250マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドでサンプルを固定します。すぐにチューブをボルテックスし、摂氏4度の暗所でインキュベートします。20分後、細胞を新鮮な洗浄バッファーで洗浄し、遠心分離によって細胞をペレット化し、ペレットを乱すことなく上清をデカントします。

細胞を500マイクロリットルの透過処理バッファー、ボルテックスに再懸濁し、暗所で室温で10分間インキュベートします。次に、細胞を洗浄してペレット化します。次に、前述のように上清をデカントします。50マイクロリットルの細胞内染色マスターミックスを適切なチューブに加えます。各サンプルをボルテックスし、室温で暗所で30分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞を洗浄してペレット化します。これで、サンプルをフローサイトメーターで取り込む準備が整いました。

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最終更新:29 8月 2026