単一細胞からのタンパク質分泌物を検出するための局在表面プラズモン共鳴イメージング

、カルボキシル基を含む自己組織化単層を備えた機能化された金ナノ構造アレイを備えたガラスセンサーチップから始めます。

チップをマイクロ流体アセンブリ内に固定し、リンカーを導入してカルボキシル基を活性化します。

ペプチドリガンドを添加し、リンカーを介して活性化されたカルボキシル基と結合します。

不活性化剤化合物含有バッファーで処理し、非特異的結合部位を不活性化し、バッファーで洗浄します。

光をチップに焦点を合わせます。局所的な表面プラズモン共鳴画像システムを使用して、暗い背景に対して明るい正方形として見えるアレイの画像を取得します。

共鳴角では、金の電子が光を吸収します。対応する角度で反射光の強度を測定して、センサー応答を生成します。

チップに結合して洗浄するタンパク質分泌ハイブリドーマ細胞を導入します。

付着した細胞は、近くのアレイ上のリガンドと相互作用するタンパク質を分泌します。

これらの相互作用により反射光の角度と強度が変化し、センサーの応答が変化し、細胞の分泌活性が確認されます。

局所的な表面プラズモン共鳴(LSPRチップ)を洗浄および再生するために、5%の水素と95%のアルゴンの300ミリリットルの混合物で40ワットの電力でプラズマ灰を45秒間処理します。SPOとSPCの比率を3対1の比率で構成する2成分エタノールチオール溶液にチップを浸漬することにより、プラズマ灰化直後の金表面とナノ構造を官能化します。チップをチオール溶液に一晩放置して自己組織化単層を形成した後、エタノールですすぎ、窒素ガスで乾燥させます。

LSPRチップをアルミニウム製の底片に置き、カスタムメイドのマイクロ流体ホルダー内にロードします。次に、この底片とシリコンガスケット、および4本のネジを使用して透明なプラスチックの上部片の間にチップを挟み込み、アセンブリをクランプします。

典型的なSPCベースのチオールアプリケーションでは、133ミリモルのEDCと33ミリモルのNHSの1対1の混合物を300マイクロリットルを脱イオン蒸留水中にドロップコートして、SPCチオール成分のカルボキシル基を活性化します。10分間待った後、10ミリモルPBSで表面を手動ですすぎます。

これに続いて、300マイクロリットルのリガンド溶液をドロップコーティングすることにより、活性化されたカルボキシル基を目的のリガンドと共役させます。1時間待って10ミリモルPBSで表面をすすぎ、300マイクロリットルの0.1モルエタノールアミンをチップ上のPBSにドロップコートして、非特異的結合を最小限に抑えます。10分間待った後、エタノールアミンを0.005%トゥイーン20またはPBS-T20を含むPBSで洗浄します。

次に、チップの上に石英片を配置して、メニスカスの変化に関連するデータの変動を減らします。顕微鏡に取り付けるときは、PBS-T20バッファーでチップを濡らした状態に保ちます。マイクロ流体チューブをアセンブリに取り付け、定常状態に達するまでバッファーを流します。次に、LSPRチップアセンブリを加熱されたステージサンプルホルダーにしっかりと配置します。

この方法の光学セットアップを次に示します。ハロゲンランプからの光は、長さ593ナノメートルのパスフィルターを通過して、ナノプラズモン応答に寄与しない波長を除去します。次に、光は線形偏光され、プラズモン金ナノ構造の励起のための40x 1.4の開口数対物レンズを介してサンプルが照らされます。散乱光は対物レンズによって収集され、交差偏光子を通過してガラス基板からのバックグラウンド信号を低減します。50/50ビームスプリッターは、分光解析と画像解析を同時に行うために、収集された光路に挿入されます。

アセンブリと顕微鏡を少なくとも2時間平衡させた後、ジョイスティックを使用してチップを位置合わせし、中央アレイが分光用の光ファイバーと位置合わせされるようにします。ハイブリドーマ細胞を遠心分離して培養・ペレット化した後、採取します。次に、LSPRチップに導入する前に実行可能性をテストします。これに続いて、マイクロピペットを使用して50マイクロリットルの細胞溶液をLSPRチップに手動で導入します。最後に、マイクロ流体灌流システムを使用して、新鮮な無血清培地で溶液中の残りの細胞を洗い流し、イメージング用のLSPRチップを準備します。