哺乳類細胞におけるバルクオートファジー隔離活性の定量化

バルクオートファジーには、オートファジー貨物と乳酸デヒドロゲナーゼまたはLDHを含む可溶性細胞質タンパク質をオートファゴソーム内に隔離して分解することが含まれます。

バルクオートファジー活性を反映してLDH隔離を評価するには、オートファジーリソソーム分解をブロックするために阻害剤で処理された栄養不足細胞を含むエレクトロポレーションキュベットを取ります。

エレクトロポレーションを実行して、細胞膜を選択的に破壊し、可溶性タンパク質を放出します。

細胞成分を保存するために、細胞破壊物を緩衝スクロース溶液と混合します。

必要な希釈した破壊物溶液を緩衝液含有チューブに移します。遠心分離機で非隔離LDHをオートファゴソーム隔離LDHから分離します。

細胞LDH全画分を含む残りの希釈した破壊物溶液を別のチューブに移します。

非イオン性界面活性剤含有バッファーを両方のチューブに追加して、隔離されたLDH画分と総LDH画分を抽出します。

LDH含有上清を遠心分離し、ピルビン酸とNADHを含む緩衝液含有チューブに移します。

LDHはNADH酸化によりピルビン酸を乳酸に変換し、LDH濃度と相関するNADHレベルを低下させます。

降画分および総細胞画分中のLDHを定量化して、LDH隔離を決定します。

ピペットを使用して、細胞ペレットを再懸濁し、ほぼ単一細胞懸濁液を得る。この懸濁液を4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットを指数減衰波エレクトロポレーターに入れ、800ボルト、25マイクロファラッド、400オームで単一の電気パルスを放電します。

新しいピペットチップを使用して、細胞を破壊した細胞を400マイクロリットルの氷冷リン酸緩衝スクロース溶液を含む1.5ミリメートルの微量遠心チューブに移し、ピペッティングで短時間混合します。この再懸濁、電極破壊、および混合プロセスを各サンプルに対して繰り返します。手順を初めて実行する場合は、本文に記載されているように、効率的かつ選択的な原形質膜電極の破壊を必ず確認してください。

降LDH画分を得るには、希釈した各細胞破壊溶液から550マイクロリットルを取り出し、0.5%BSAおよび0.01%トゥイーン-20を含む900マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーを含む独自の2ミリリットル微量遠心チューブに移します。簡単にピペットで混ぜます。18,000倍g、摂氏4度で45分間遠心分離し、沈殿したLDHを含むペレットを作製します。吸引を使用して、上清を完全に吸引し、ペレットをできるだけ乾燥させたままにします。

殿したLDHサンプルは、分析の準備が整うまで摂氏マイナス80度で保管します。総LDH画分については、希釈した細胞破壊溶液のそれぞれから150マイクロリットルを独自の新しいチューブに移します。分析の準備が整うまで、これらを摂氏マイナス80度の冷凍庫に保管します。

殿したLDHサンプルとLDHサンプル全体の両方を氷上で解凍します。解凍したら、1.5%Triton X-405を含む300マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーをLDHサンプル全体に加えます。冷蔵室でローラー上でサンプルを30分間回転させます。次に、1%Triton X-405を含む750マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーを沈殿したLDHサンプルに加えます。ピペットを使用して、溶液が均一になるまでペレットを再懸濁します。すべてのサンプルを摂氏4度で18,000 g で5分間遠心分離し、未溶解の細胞破片を沈殿させます。

遠心分離が完了したら、サンプルを氷の上に置きます。本文に記載されている古典的な酵素アッセイ、または市販の多種多様なキットのいずれかを使用して、上清中のLDHのレベルを測定します。