結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

確立された結核菌またはMtb感染モデルを含むマルチウェルプレートを取ります。

ウェルには、感染していないマクロファージに囲まれた、密に詰まったMtbおよびMtbに感染した壊死性マクロファージのコアを含む細胞凝集体が含まれており、in vivo感染を模倣しています。

抗生物質リファンピシンとモキシフロキサシンを連続希釈してください。

感染プレートから培地を廃棄し、抗生物質希釈液をウェルに移し、インキュベートします。

抗生物質は細胞凝集体を通って拡散し、細菌細胞に入ります。

リファンピシンは細菌の RNA ポリメラーゼに結合し、RNA 合成を阻害し、細菌の死を引き起こします。

モキシフロキサシンは細菌のDNAトポイソメラーゼに結合し、複製を阻害し、細菌の増殖を阻止します。また、結合により、活性酸素種の蓄積などのストレス反応が誘発され、細菌が死滅します。

インキュベーション後、酸化還元指示薬であるレサズリンを追加します。生きた代謝活性細菌の内部では、酸化還元酵素が青色のレサズリンをピンク色の蛍光レゾルフィンに還元します。

蛍光を測定して生菌を検出します。

細菌の生存率は抗生物質濃度の増加とともに減少し、Mtb に対する有効性を示します。

薬物検査のために、次のように新しい96ウェルプレートに2つの抗結核薬を3回調製します。まず、125マイクロリットルの7H9-C培地をウェルB2からG10に加えます。次に、1ミリリットルの7H9-Cで2つの薬物を所望の最高最終濃度の2倍で調製します。

ピペットを使用して、各薬剤をウェルB、C、およびD-11に250マイクロリットルを加え、次にE、F、およびG-11をそれぞれ3回処理します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、125マイクロリットルをB11からG11からB10からG10に移動して、試験薬を連続的に2倍に希釈します。各ステップで5回ピペッティングして混合します。

125マイクロリットルをカラムからカラムへ、プレートを右から左に移動し続け、カラム4の後に停止します。列4を混合した後、125マイクロリットルを廃棄物容器に捨てます。2列目と3列目には薬物が含まれていてはなりません。これにより、背景として、またポジティブな成長制御に使用できるようになります。

次に、Mtbに感染したマクロファージを含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。プレートを傾けずに、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルB2からG11まで150マイクロリットルの培地を除去します。次に、ここに示すようにプレートを傾け、ピペットチップをウェルの下端に挿入し、残りの培地(約50マイクロリットル)を取り除きます。

Mtbマクロファージ凝集体が井戸の底に付着するため、材料が失われることはありません。ただし、培地の除去はできるだけ穏やかに行