ウイルス感染の抗体依存性増強を調べるためのin vitroアッセイ

ジカウイルスに対する抗体を含む血清サンプルを段階的に希釈したマイクロプレートを取ります。

デング熱レポーターウイルス粒子またはRVPを加え、インキュベートします。

改変されたRVPは、構造タンパク質を含むエンベロープと、蛍光タンパク質をコードするゲノムRNAを含むヌクレオカプシドで構成されています。

デング熱ウイルスとジカウイルスのエンベロープタンパク質の構造相同性により、抗体はRVPと交差反応し、複合体を形成します。

RVPによる感染に許されないヒト白血病細胞を追加します。

細胞はRVP結合抗体を認識するFc受容体を有しており、抗体依存性増強またはADEと呼ばれるRVPのエンドソームへの侵入を促進します。

細胞をペレット化し、内在化されていないRVPを含む上清を廃棄します。増殖培地を加えてインキュベートします。

RVPとエンドソーム膜のpH依存性融合によりヌクレオカプシドが放出され、ヌクレオカプシドが分解されてゲノムRNAが放出され、蛍光タンパク質の発現が可能になります。

細胞を固定し、フローサイトメトリーを使用して分析します。

適切な抗体濃度で蛍光が高いほど、RVPの内在化が増加し、感染が強化されていることを示しています。

まず、血清サンプルを室温で解凍します。解凍したら、各血清サンプル100マイクロリットルを滅菌チューブに移し、摂氏56度で30分間熱不活化します。

次に、コールドRPMI-10で1対1から1から1,000の範囲の血清サンプルを10倍に連続希釈します。次に、希釈した各血清サンプル10マイクロリットルを滅菌96ウェルVボトムプレートのウェルに移します。

次に、デング熱1、2、3、および4のレポーターウイルス粒子を摂氏37度のウォーターバスで解凍し、血清サンプルあたり各RVPの体積が約170マイクロリットルになるようにします。解凍したら、すぐにRVPのチューブを氷に移します。次に、10マイクロリットルのRVPを、血清サンプル希釈液を含むウェルにピペットで、無血清コントロールウェルに移します。ピペッティングを上下に5〜10回ピペッティングしてよく混ぜます。

96ウェルVボトムプレートをインキュベーターに移し、5%の二酸化炭素の存在下で摂氏37度で1時間インキュベートします。96ウェルVボトムプレートのインキュベーション中に、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールで洗浄し、UVライトを15分間照射します。

次に、K562細胞の完全にコンフルエントなT75フラスコをインキュベーターから取り出します。滅菌5ミリリットルピペットを使用して細胞をよく混合し、5ミリリットルを滅菌15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、チューブから10マイクロリットルの細胞を取り出します。10マイクロリットルのトリパンブルーと混合し、血球計算器にロー